Диссертация (1145986), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Сутьдальнейшейобработкиданныхсводиласьквыявлениюиописаниюотдельныхr122Все значения энергий в таблице приведены в ккал/моль. Значения ∆V рассчитаны по формуле ( E − V (r )) ,α + E − V (r )приведенной в данном разделе.48конформационных изменений белка, для чего применялся метод факторного анализа, а такжеустановлению временноJго порядка этих изменений с помощью кросскорреляционного анализа.Оба исследования проводились с использованием программы SPSS [98].Таблица 2.2 – Параметры, выбранные для описания перехода А-домена RIα из H- в ВконформациюПараметрЧто характеризует параметрRMSDB(ФСК), ÅG199(O)–A202(N), ÅE200(O)–I204(N), ÅL201(O)–Y205(N), ÅКонформация ФСКA202(O)–T207(N), ÅE (L203/G169,D170,N171), ккал/мольG169(N)–T207(O), ÅG169(N)–G206(O), ÅL201(N)–цАМФ(O6), ÅПоложение ФСК относительно β2β3-петлиСвязывание цАМФA202(N)–цАМФ(O3`), ÅE (L203,I204/L135,F136), ккал/мольL135(Cα)–I204(Cα), ÅПоложение N3A-мотива относительно ФСК иE (Y229/L135,F136), ккал/мольС-спиралиRMSDB(N3A), ÅRMSDB(B/C-h), ÅE (Y229/F172,E200,L203,I204), ккал/мольY229(O)–M234(N), ÅR230(O)–M234(N), ÅR230(O)–G235(N), ÅR231(O)–G235(N), ÅE (L233/L135,F136,L139), ккал/мольE (M234/I204), ккал/мольR231(O)–S236(N), ÅI232(O)–S236(N), ÅE (R241/E200), ккал/мольE (L238/I204), ккал/мольПоложение и конформация С-спирали49Факторный анализ13 по методу главных компонент выполнялся в отдельности длякаждого этапа каждой траектории.
По его результатам были выявлены факторы, которыеобъединяли коррелирующие между собой параметры. В общем случае, независимо от типаданных, за каждым из факторов стоит скрытая от наблюдения характеристика (латентнаяпеременная). В приложении к нашим данным латентной переменной является одно илинесколько одновременно протекающих конформационных изменений белка. Среди всехфакторов, собственные числа которых превышали 1 (критерий Кайзера), нас интересовалитолько те, которые можно было соотнести с направленными во времени конформационнымиизменениями. Эти факторы мы исследовали с использованием кросскорреляционного анализа.Так как значения исходных параметров зависят от времени, то от времени зависят изначения латентных переменных (факторные значения).
Промежутки времени, в течениекоторыхпроисходилиосновныеизмененияпоследних,мыобозначиликакстадииконформационного перехода и определили порядок их следования в пределах каждого этапа.Для этого были рассчитаны кросскорреляционные функции зависимостей от времени всех паррассматриваемых латентных переменных.
При установлении порядка стадий в пределахтраекторий учитывалась также очередность этапов, на которые первоначально эти траекториибыли разделены.Результаты анализа для каждой траектории приведены в приложении В и представлены ввиде факторов, расположенных в порядке следования во времени соответствующих им стадий.Дальнейшей статистической обработке результаты исследования не подвергались. Тем не менеевизуально структура факторов, их количество и порядок наступления стадий сравнивалисьмежду опытами.
По итогам сравнения удалось установить, что существуют группы параметров,коррелирующих друг с другом во всех опытах, и соответственно всегда объединенных в одинфактор. Мы предположили, что этим группам соответствуют элементарные, обязательные длярассматриваемого перехода конформационные изменения белка, которые удобно называтьсобытиями.
Полученные нами пути перехода А-домена из H- в В-конформацию состояли изразного количества стадий, но все они включали в себя ровно семь событий, и эти события неразличались между опытами. Исходя из сделанного наблюдения, мы рассмотрели механизмH→B конформационного перехода А-домена как последовательность выявленных событий ипривели его описание в главе 6.13Автор глубоко признателен Вершининой Е. А. за помощь в проведении факторного и кросскорреляционногоанализов502.5. Дополнительные программы и методики, применяемые при постановкемоделирований и анализе их результатов2.5.1.
Выравнивание пространственных структур цАМФ-связывающих доменов и расчетRMSD между нимиRMSD14 представляет собой численную меру различия двух пространственных структуродинаковых или схожих молекул (или их фрагментов) и определяется по формуле:RMSD =∑Ni =1(r (t ) − r (t ))2i1Ni2, гдеN – число атомов, положения которых сравниваются,ri (t ) – положение i-ого атома молекулы t (если сравнение идет между разнымимолекулами) или же t обозначает момент времени (если исследуется изменение RMSDмолекулы в течение некоторого промежутка времени).С последним вариантом связано использование RMSD как характеристики переходамолекулы из одной конформации в другую.
В таком случае задают функцию RMSD(t), каждаяточка которой определяет меру отличия конформации молекулы в момент времени t и от той ееконформации, которая должна реализоваться в результате рассматриваемого перехода. Поповедению этой функции можно составить представление о скорости процесса перехода,степени его протекания, а также о количестве стадий его составляющих.
В настоящейдиссертации было использовано пять таких функций. Четыре из них характеризуютконформацию надвторичных структур А-домена (ФСК, B/C-спирали и N3A-мотива), а также Адомена в целом по отношению к B-конформации: RMSDB(ФСК), RMSDB(B/C-h), RMSDB(N3A)и RMSDB(A) соответственно. Пятая функция, RMSDH(ФСК), представляет собой меруудаленности текущей конформации ФСК от ее H-конформации15.
Анализ перечисленныхфункций применялся в ходе решения трех задач: кластеризации конформаций β-субдомена(раздел 2.3, глава 5), определения полноты протекания конформационного перехода А-домена(раздел 6.1) и выявления механизма этого перехода (разделы 2.4, 6.2 – 6.4). В методиках,14Аббревиатура RMSD расшифровывается либо как среднеквадратичное отклонение (root mean square deviation),что более привычно, либо как среднеквадратичное расстояние (root mean square distance), что лучше описываетконкретные задачи.
Действительно, при изучении пространственных структур белков, кроме задачи сравнениязаданной структуры с ее математическим ожиданием, часто возникает необходимость сравнить или выравнять рядструктур, непосредственно полученных в ходе компьютерного или физического эксперимента. Говорить в этомслучае о среднеквадратичном отклонении мы считаем не совсем корректным.15При расчете RMSD здесь и далее учитывались только атомы основной цепи: N, Cα, C51основанных на применении факторного или кластерного анализа, рассматривался весь спектрзначений RMSD, полученный в ходе моделирования. В противоположность этому в рамкахвторой задачи учитывались лишь те отрезки времени, на которых графики всех исследуемыхфункций RMSD выходили на плато, и этот выход можно было предварительно соотнести собразованием В-конформации. В таком случае значения RMSD на выбранных участкахусреднялись по времени.
Итоговые средние значения использовались для подтверждения илиопровержения предположения о достижении B-конформации.Минимизация RMSD между пространственными структурами белков называется ихвыравниванием. В настоящей диссертации выравнивание проводилось по атомам, неизменяющим свое положение в ходе конформационных изменений белка, и предшествовалопостроению названных выше RMSD функций. Необходимость выравнивания в данном случаеобусловлена движением центра масс белка, приводящим к появлению компоненты,завышающей реальные значения анализируемых RMSD. Кроме того, иллюстрации, сделанныепосле устранения этой компоненты, более наглядно описывают конформационные изменениябелка. К числу «неподвижных» атомов в А-домене относятся атомы основной цепи (N, CA, C)аминокислотных остатков V154 – I163, Y173 – V182, T190 – G195, K214 – I224, а в В-домене имсоответствуют атомы остатков V272 – V281, F291 – V300, G314 – S319, V338 – L348. Названныефрагменты белковой цепи образуют β-слои β-субдомена и не включают в себя остаткиконформационно подвижных ФСК, β2β3-петли и других петель между β-слоями.Расчет RMSD и выравнивание пространственных структур А- и В-доменов проводилисьс использованием программы VMD [103].2.5.2.
Измерение углов между спиралямиУглы между осями спиралей были измерены с помощью программы MOLMOLверсии 2K.2 [104].2.5.3. Визуализация третичных структурВизуализация всех исследуемых белковых комплексов ПКА Iα выполнялась сиспользованием программы VMD [103].523. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ СО СВЯЗЫВАЮЩИМИ САЙТАМИ А- ИB-ДОМЕНОВ ПКА IααВ первой из четырех глав, посвященных изложению полученных нами результатов,приведены данные, полученные с использованием методов докинга и квантово-химическогоанализа и характеризующие взаимодействие лигандов (цАМФ, Sp-цАМФS и Rp-цАМФS) сцАМФ-связывающими сайтами А- и В-доменов R-субъединицы ПКА Iα.Дополнением к главе является предложенная нами термодинамическая модель активацииПКА Iα (приложение Б).
Ее создание было обусловлено необходимостью объяснить различиемежду определенными в ходе докинга и измеренными экспериментально значениями константсвязывания лигандов с А- и В-доменами RIα субъединицы. Однако эта модель пригодна такжедля оценки справедливости значений других констант, характеризующих активацию ПКА Iα.Последний факт немаловажен, так как, судя по данным, приведенным в таблицах 1.1 и 1.2,между результатами экспериментальных измерений существует много противоречий.3.1 Докинг цАМФ в цАМФ-связывающие сайты А- и B-доменов ПКАВ рамках данной работы был проведен докинг цАМФ в цАМФ-связывающие сайты А- иВ-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
