Диссертация (1145986), страница 28
Текст из файла (страница 28)
В качестве доказательств этой модели приводятдестабилизацию B-конформации у мутантов D170A [35] и блокирование конформационногоперехода А-домена антагонистом ПКА Rp-цАМФS, происходящее, по предположению авторовмодели, из-за нарушения свойств связи Rp-цАМФS с R209 [65]. К сожалению, модельэлектростатического«переключателя»необъясняет,какимобразомпроисходитконформационный переход в отсутствии лиганда или в доменах, лишенных аспарагиновойкислоты в положении гомологичном D170 (подробнее в разделе 6.5.2). Также она игнорируеттот факт, что мутационные замены D170 и ряд мутационных замен R209 не нарушаютконформационный переход А-домена [35, 105, 34]. И наконец, отсутствует самое главное,прямое, доказательство, демонстрирующее блокирование конформационного перехода приразобщенииэлектростатического«переключателя».Одновременносисследованиями,проводимыми в лаборатории Сьюзен Тэйлор, группе Хольгера Рехманна на модели цАМФсвязывающегодоменабелкаEPACудалосьпоказатьсуществованиегидрофобного«переключателя» [30, 33].
Механизм его действия, по мнению Рехманна, основывается на том,что положения боковой цепи L203 (ФСК) в H- и B-конформациях различны. В H-конформацииона как бы упирается в ароматическое кольцо Y229 (B/C-спираль), препятствуя повороту B/Cспирали, а в В-конформациии дает ему возможность осуществиться.
Модель гидрофобного«переключателя» в отличие от модели электростатического «переключателя» доказанаэкспериментально: замена L203 на более объемный триптофан блокирует конформационныйпереход, а замены Y229 на аланин и треонин, напротив, дестабилизируют H-конформацию [33].Однако в работах Рехманна не говорится о том, каким образом информация о связываниилиганда передается на L203, а значит вопрос о механизме, запускающем конформационныйпереход, остается открытым.Внести ясность в эту картину, казалось бы, должны были расчетные работы. Таких работбыло несколько [36, 44, 72], но только в одной из них проводились исследования отдельногоцАМФ-связывающего домена (А-домена ПКА Iα) [36]. В этой работе была предпринятапопытка методами стандартной молекулярной динамики показать переход А-домена Rсубъединицы ПКА Iα из B- в H-конформацию. Для этого А-домен (а. о.
110 – 242)моделировался в NPT ансамбле в отсутствие лиганда в течение 40 нс. За время расчетапроисходил разрыв связи R241–E200 и, как следствие, образование единой B/C-спирали, что27Вообще любой молекулярный «переключатель» должен представлять собой цепочку групп атомов,взаимодействие между которыми реализуется разными способами в зависимости от отсутствия или присутствиялиганда, а переключение между этими способами запускает конформационный переход.115соответствует показанному нами событию И, реализованному в обратном порядке. Дальнейшиесобытия перехода авторам исследования показать не удалось, несмотря на то, что временамоделирования в их и нашей работе были сопоставимы. Таким образом, объяснений идополненийкмеханизмамфункционированиягидрофобногоиэлектростатического«переключателя» в рамках этой работы получено не было.Ответ на вопрос, почему нам удалось получить переход между конформациями, лежит нетолько в применении нами методов ускоренной молекулярной динамики, но и в удачнойпостановке задачи.
Дело в том, что в отсутствие цАМФ переходы между H- и В-конформациямиА-домена оказываются довольно редким явлением, поэтому получить их трудно. ПрисутствиецАМФ в связывающем сайте понижает устойчивость H-конформации и увеличивает таковую Bконформации, что приводит к увеличению и уменьшению соответственно частот H→B и B→Hконформационных переходов. Поставив целью своей работы моделирование H→B перехода вприсутствии цАМФ, мы, таким образом, имели дело с наименее трудной задачей.Иллюстрацией этого факта служит то, что в четырех из тринадцати опытов В-конформациябыла достигнута без применения потенциалов уМД, то есть в рамках стандартноймолекулярной динамики.Врезультате,стартовавсудачноймодели,мысмоглинетольковпервыепромоделировать конформационный переход цАМФ-связыващего домена, но и ответить насуществующие вопросы относительно механизмов функционирования электростатического игидрофобного «переключателей».Идея электростатического «переключателя» изначально являлась очень привлекательнойдля объяснения конформационных изменений цАМФ-связывающих доменов, так как фосфатнаягруппа цАМФ несет отрицательный заряд, а в цАМФ-связывающем сайте имеется такойположительно заряженный центр как R209.
Однако нам удалось показать, что переключениевзаимодействий в цепочке R209–D170–R226 не играет роли в конформационном переходе Адомена, а только, вероятно, приводит к стабилизации реализовавшейся конформации. Тем неменее опровержение одной модели электростатического «переключателя» не означает отказа отсамой идеи. Конформационный переход А-домена (и, видимо, других цАМФ-связывающихдоменов) действительно запускается электростатическим «переключателем», и нам удалось егообнаружить. В А-домене ПКА Iα он представлен цепочкой цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O).В ответ на связывание лиганда амидная группа A202 переключается с карбонильной группыG199 на атом кислорода О6 фосфатной группы цАМФ и этим запускает череду событий,приводящих в конечном итоге к достижению B-конформации.
Одно из этих событий,упаковывание боковой цепи L203 в гидрофобный карман, является первым элементомгидрофобного «переключателя», открытого Хольгером Рехманном. То есть срабатывание116обнаруженного нами электростатического «переключателя» и есть тот самый механизм,который передает сигнал о связывании лиганда на гидрофобный «переключатель». Модельпредложенную Рехманном нам удалось не только подтвердить, но и дополнить важнымидеталями, а кроме того мы показали, что не только гидрофобный «переключатель», но и другиегидрофобные взаимодействия играют важную роль в конформационном переходе А-домена(например, взаимодействие L233 с N3A-мотивом, приводящее к появлению витка π-спирали).Ответив на большинство вопросов, поставленных экспериментальными работами, мы,тем не менее, не считаем нашу модель конформационного перехода А-домена исчерпывающей,таккакотсутствиеучетаэнергетическихаспектовконформационныхизмененийсвидетельствует о ее неполноте.
Проведение соответствующих расчетов стоит в планах нашихпоследующих исследований.6.5.2. Применимость полученных результатов к другим цАМФ-связывающим доменамВ заключение проделанной работы представляется интересным оценить, насколькопредложенный нами механизм перехода А-домена ПКА Iα из H- в В-конформацию применим кдругим цАМФ-связывающим доменам. Для ответа на этот вопрос из базы третичных структурбелков (PDB) мы выбрали все белки, имеющие в своем составе цАМФ-связывающие домены,конформационный переход в которых запускается циклическими нуклеотидами.В банке третичных структур присутствуют и другие цАМФ-связывающие домены28,например,гем-содержащиеилиуправляемыехлорфенолами.Онивходятвсоставтранскрипционных факторов прокариот и содержат все те же элементы вторичной структуры,что и цАМФ-связывающие домены, управляемые циклическими нуклеотидами.
Итогомперехода в В-конформацию у тех и других доменов является поворот С-спирали, которыйпередает информацию о случившемся изменении конформации на другие домены или белковыемолекулы. Однако между названными доменами есть и существенное различие. У доменов, неимеющих сродства к циклическим нуклеотидам, нет ФСК, а следовательно, в лигандсвязывающем сайте происходят процессы, коренным образом отличающееся от описанныхнами. По этой причине мы решили исключить такие структуры из нашего анализа, но неисключаемвозможностиицелесообразностиихпринципиальногорассмотрениявсовокупности с остальными цАМФ-связывающими доменами.В результате, среди выбранных нами белков оказались транскрипционные факторыпрокариот (CAP и другие), HCN каналы (собственно HCN и spIH), CNG каналы, белок EPAC2 иширокий28спектрпротеинкиназА.ВозможностьпроанализироватьмежвидовыеиВ данном случае определение «цАМФ-связывающие» - лишь часть названия, отражающее высокую степеньгомологии с истинно цАМФ связывающими доменами.117внутривидовые различия последних появилась благодаря фундаментальной работе Canaves исоавторов [24], которые выравнили аминокислотные последовательности А и B доменов ПКАот альвеолят до позвоночных.
В приведенных ими последовательностях, а также в отобранныхнами третичных структурах, мы искали аминокислотные остатки, гомологичные тем, которыевыделили как ключевые для А-домена ПКА Iα, а также другие, имеющие, на первый взгляд,решающеезначениедляконформационныхпереходовцАМФ-связывающихдоменов.Полученные в результате данные мы представили в виде таблицы (таблица 6.2).Как видно из приведенного материала, все рассмотренные цАМФ-связывающие доменынам удалось разбить на три типа. К первому типу относятся домены транскрипционныхфакторов прокариот, А-домен белка EPAC и домены HCN и CNG каналов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
