Диссертация (1145986), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Второй типпредставлен А-доменами ПКА и B-доменом белка EPAC. Третий тип доменов образуют толькоB-домены протеинкиназ А. Эволюция, по нашим представлениям, шла от первого типа доменовк третьему. Но поскольку для оценки соответствия наших взглядов истине нужныдополнительные исследования, мы ограничились только описанием выявленных типов доменовс указанием на возможные механизмы их конформационных переходов.В первом типе цАМФ-связывающих доменов (рисунок 6.9 А) можно выделить дваподтипа. Наиболее примитивным из них представляется подтип А, в который входят доменытранскрипционных факторов прокариот и А-домен белка EPAC.
ФСК этих доменов либолишена четко выраженной спиральной структуры, либо даже в отсутствие лиганда близка к Bконформации. При этом для образования связи между лигандом и амидной группой гомологаA202 всегда требуется гораздо меньшее смещение последней, чем в случае А-домена ПКА Iα.Вместе с тем реализующуюся в таких доменах B-конформацию нельзя считать истинной, таккак упаковывания гомолога L203 в гидрофобный карман при связывании цАМФ не происходит.Одна из возможных причин состоит в том, что остатки изолейцина и метионина, частонаходящиеся на месте искомого лейцина, стерически не соответствуют форме кармана. Такжевероятно, что взаимодействие с гидрофобным окружением за пределами кармана является длягомолога L203 более выгодными. В любом случае отсутствие упаковывания гомолога L203 вгидрофобный карман приводит к тому, что гидрофобный «переключатель» в доменах типа 1Ане реализован, и поворота B-спирали в ответ на связывание лиганда не происходит29.
N3A-29Вместо ключевого взаимодействия, лежащего в основе гидрофобного «переключателя», (в А-домене ПКА IαL203-Y229), в цАМФ-связывающих доменах типа 1А реализуется стабильный не зависящий от конформации белкагидрофобный кластер, состоящий из трех аминокислотных остатков: гомологов F172, Y229 и L203. Геометрияэтого кластера в разных доменах неодинакова. Чаще всего наблюдается ситуация, когда каждый из трех остатковконтактирует с двумя другими, но встречаются и отличные варианты. Например, у А-домена белка EPAC гомологиL203 и F172 между собой не контактируют, при этом боковая цепь гомолога Y229 располагается между ними,образуя с каждым из них тесные контакты.
У CAP M.flagellatus и T.thermophilus не контактируют гомологи F172 и118мотив у рассматриваемых доменов или отсутствует или занимает то же положение, что в Bконформации А-домена ПКА Iα, то есть смещен в сторону от β-субдомена и ФСК и не образуетв H-конформации контактов с последней. B-спираль доменов типа 1А длиннее на один остатокB-спирали А-домена ПКА Iα, а на ее С-конце находится аминокислотный остаток сторсионными углами, характерными для β-слоя (остаток β1, таблица 6.2). Наличие такогоостатка приводит к появлению постоянного не зависящего от конформации белка излома междуB- и С-спиралями, и B/C-спираль как единая структура у данного типа доменов не образуется.Вовсехрассмотренныхнамидоменахтипа1Афункциюкэпа(подробнеераздел 1.3.1) выполняет остаток аргинина, принадлежащий С-спирали. В зависимости отособенностей строения B- и С-спиралей его положению в пространстве над ароматическимкольцом лиганда могут соответствовать разные положения в первичной последовательностибелка.
При связывании лиганда искомый аргинин образует π-электронное взаимодействие сароматическим кольцом последнего, вследствие чего С-спираль сближается с ФСК. Вероятно,это движение является единственно возможным для доменов типа 1А, и названный процесспредставляет собой механизм конформационного перехода этих доменов. У транскрипционныхфакторов прокариот на С-конце С-спирали располагается ДНК-связывающий домен, а обладаютактивностью такие факторы только в составе гомодимера. Движение С-спиралей в ответ насвязывание цАМФ вызывает изменение положения ДНК-связывающих доменов друготносительно друга, в результате чего транскрипционный фактор приобретает способностьвзаимодействовать с ДНК.Согласно нашим представлениям, цАМФ-связывающие домены, не управляемыециклическими нуклеотидами, имеют сходное строение с доменами типа 1А, и на связываниелиганда отвечают таким же изменением конформации.
Отличительной их особенностьюявляется лишь отсутствие ФСК.К доменам первого типа подтипа Б относятся цАМФ-связывающие домены HCN и CNGканалов. Визуально они похожи на домены подтипа А, однако между теми и другими естьсущественные различия. Во-первых, остатком гомологичным L203 у доменов типа 1Б являетсялейцин. В В-конформации он всегда упакован в гидрофобный карман, что приводит квозникновению гидрофобного «переключателя» и приобретению B-спиралью способностиповорачиваться в ответ на связывание лиганда.
Во-вторых, N3A-мотив доменов этого типасмещен в сторону от ФСК только в В-конформации, а в H-конформации образует такой жеY229, а связь между ними осуществляет гомолог L203. Последний случай наиболее интересен, так как, еслипредположить, что домены типа 1А являются предковыми для остальных цАМФ-связывающих доменов, тоименно из гидрофобного кластера такой геометрии мог развиться гидрофобный «переключатель».
Стоит отметить,что вклад F172 в гидрофобное окружение Y229 сохраняется и в А-домене ПКА Iα. Энергию взаимодействия Y229с ФСК и β-субдоменом мы рассчитывали с учетом этого факта.119контакт с ней, как и в А-домене ПКА Iα. Исходя из названных особенностей строения доменовтипа 1Б, их переход из H- в B-конформацию, вероятно, должен происходить в три этапа.
Напервом этапе в ответ на связывание лиганда B-конформацию принимает ФСК. На втором – засчет срабатывания гидрофобного «переключателя» и смещения N3A-мотива поворачивается Bспираль. На третьем этапе образуется π-электронное взаимодействие между аргинином Сспирали, выполняющим функцию кэпа, и ароматическим кольцом лиганда, в результате чего Сспираль сближается с ФСК. Если сравнивать этот гипотетический механизм конформационногоперехода с механизмом, предложенным нами для А-домена ПКА Iα, можно заметить, чтосущественные различия между ними проявляются только на втором этапе.
На этом этапе у Адомена ПКА Iα помимо поворота B/C-спирали и смещения N3A-мотива формируется участок πспирали. На его месте впоследствии образуется излом, разделяющий B/C-спираль на двеотдельные B- и С-спирали. У доменов типа 1Б эти спирали и так существуют как отдельныеструктуры, так как во всех конформациях между ними находится шарнирный остаток β1 (см.домены типа 1А, таблица 6.2, рисунок 6.8 А), и дополнительных стадий, приводящих к ихразделению, не требуется.Для второго типа цАМФ-связывающих доменов (рисунок 6.8 Б, В), к которым относитсяирассмотренныйнамиА-доменПКАIα,характерныработающийгидрофобный«переключатель» и отсутствие β1 остатка, превращающее B- и С-спирали в единую B/Cспираль.
Положение N3A-мотива в данном типе доменов может различаться. У B-доменаEPAC2 он, независимо от конформации, смещен в сторону от ФСК и не образует с нейконтактов. У рассмотренных нами структур А-доменов протеинкиназ А N3A-мотив в Нконформации взаимодействует с ФСК, а в В-конформации отодвигается от нее, как описановыше (раздел 6.3.2).
Конформационный переход доменов второго типа детально изложен вразделах 6.2 – 6.4 на примере А-домена ПКА Iα.В заключение описания первого и второго типов цАМФ-связывающих доменовнеобходимо остановиться на факте, который, на наш взгляд, имеет исключительное значениедля установления путей их эволюции. Этим фактом является принадлежность А- и B-доменовбелка EPAC2 к разным типам цАМФ-связывающих доменов при высокой степени гомологии ихпервичных последовательностей. Схожесть первичных последовательностей этих доменовпредположительно говорит об их происхождении путем дупликации.
А различия третичнойструктуры и механизмов конформационных переходов несут в себе информацию о техсобытиях, которые впоследствии произошли с каждым из доменов.B-домены протеинкиназ А относятся к третьему выделенному нами типу цАМФсвязывающих доменов (рисунок 6.8 Г, Д). Основной чертой, отличающей их от доменов второготипа, является отсутствие единой B/C-спирали в совокупности с особым строением шарнирного120участка между B- и С-спиралями, не встречающимся в ранее рассмотренных доменах.Предваряет шарнир остаток, гомологичный L233. Его боковая цепь всегда повернута к N3Aмотиву, как в B-конформации А-домена ПКА Iα.
Однако вследствие С-концевого положенияэтого остатка в B-спирали, π-спиральный участок в ней не образуется. Следующие за гомологомL233 два остатка (G и P/N) формируют собственно шарнир. В H-конформации значения φ и ψторсионных углов глицина составляют 70° и 180° соответственно, а значения φ и ψ торсионныхуглов P/N характерны для β-слоя. В В-конформации оба остатка шарнира переходят в αспиральную форму. Таким образом, N-концевым остатком С-спирали в B-конформации являетсяглицин шарнира, а в Н-конформации – остаток, следующий за P/N. У некоторых доменовтретьеготипа,кромеописанногошарнира,существуетещеодин,представленныйаминокислотным остатком с торсионными углами, характерными для β-слоя (остаток β2,таблица 6.2).
Он располагается в С-концевой области С-спирали и, если следующие за нимостатки образуют α-спираль, то она носит название C`. В В-конформации С- и С`-спиралиобъединяются в единую спираль, фигурирующую в литературе под названием С-спирали.Конформационный переход доменов третьего типа с учетом перечисленных особенностей ихструктуры должен включать в себя три обязательных этапа: 1) связывание лиганда и переходФСК в В-конформацию, 2) поворот B-спирали, вследствие срабатывания гидрофобного«переключателя» и смещения N3A-мотива, и изменение конформации шарнира, 3) образованиеπ-электронного взаимодействия между ароматическими кольцами лиганда и остатка кэпа,сопровождающееся объединением С- и C`-спиралей и сближением итоговой С-спирали с ФСК.Стоит отметить, что уникальными чертами предложенного гипотетического механизмаявляются только изменение конформации шарнира и объединение С- и C`-спиралей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
