Диссертация (1145986), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Всеостальные события свойственны цАМФ-связывающим доменам других типов и детальноизучены в нашей работе.Обобщая данные, приведенные в таблице 6.2, можно сказать, что у всех типов цАМФсвязывающих доменов есть общие черты строения и определяемые ими общие этапы переходаиз H- в В-конформацию. В этом смысле можно утверждать, что предпринятое намимолекулярное моделирование вносит вклад в понимание механизма функционирования нетолько ПКА Iα, но и широкого спектра белков, включающего в себя транскрипционные факторыпрокариот, ионные каналы, белки EPAC и другие, возможно, пока неизвестные белки, в составкоторых входят цАМФ-связывающие домены.
Однако у рассмотренных доменов есть иуникальные черты строения, приводящие к появлению уникальных стадий конформационногоперехода. Все участки первичной последовательности, образующие такие уникальныеструктуры, расположены с С-конца от гомолога L233 и включают в себя область С-спирали ипредваряющего ее шарнира.
Исследование изменений конформаций этих структур необходимо121для понимания функционирования каждого конкретного домена. А поиск гомологии между ихаминокислотнымипоследовательностямиможетпролитьсветнаэволюциюцАМФ-связывающих доменов.В заключение данного раздела диссертации имеет смысл еще раз вернуться к вопросуэлектростатического«переключателя»R209–D170–R226,чтобыоценитьегорольвфункционировании цАМФ-связывающих доменов с учетом вариантов их строения. Как видноиз приведенных в таблице 6.2 данных, электростатический «переключатель» присутствуеттолько в А-доменах протеинкиназ А, в которых, однако, за редким исключением являетсяобязательным элементом.
Возможное объяснение такому избирательному присутствиюэлектростатического «переключателя» в А-доменах ПКА можно предложить с позицийустановленной нами его функции как стабилизатора конечных конформаций цАМФсвязывающих доменов. Вероятно, что B-домен ПКА, расположенный на С-конце С-спирали Адомена, понижает устойчивость B-конформации А-домена. Дополнительная стабилизация Bконформации с помощью электростатического «переключателя» в этом случае становитсянеобходимой.122Таблица 6.2 – Типы цАМФ-связывающих доменовописание доменафакторы транскрипцииПервый тип АбелокорганизмОбласть гомологии между типами доменовэ/пPDBID H/Bβ2β3-петляN3A-мотивCAPE.coli3HIF/1G6N–––A36E37L39NCAPM.tuberculosis3D0S/I10F11V14G44D45L47N4A2UVirulenceP.aeruginosa/2OZ6–––C38E39L41NCAPM.flagellatus/3GYD–––G61D62L64NCAPT.thermophilus/4EV0L6F7L10G40Q41L43NGLXRC.glutamicum4BYY/I13F14V17G47D48L50N3R6SEPAC2А-доменM.musculus2BYV/A43F44F47G77T78W80NM.loti3CO2/L235F236L239G269D270M272NHCNПервый тип БCNG1VP6HCN2M.musculus/1Q43L517F518A521G551K552M554NHCN2H.sapiens/3U10L544F545A548G578K579M581NHCN4H.sapiens/3OTFL595F596A599G629K630M632NHCN1M.musculus/3UOZL464F465A468G498K499M501NspIHS.purpuratus/2PTMF545F546A549G579D580M582NB-доменM.musculus2BYV/A338L339L342G373T374W376N3CF6А-домены ПКАВторой типEPAC2IαM.musculusB.taurus2QCS/1NE6L135F136L139G169D170F172YIIαM.musculus2QVS/L135F136L139G169D170F172NAIIβR.norvegicus3TNQ/L152F153L156G186D187F189YL184F185L188G218D219F221YL/MFLGD/E/AF/LNAI253L254L257G287D288F290N1CX4S.cerevisiae/3OF1(по Canaveset.al, [24])B-домены ПКАТретий типIαM.musculus2QCS/B.taurus1NE6IIαM.musculus2QVS/L257F258L261A291D292F294NAIIβR.norvegicus3TNQ/1CX4F274L275L278A308D309F311NS.cerevisiae/3OF1V302L303L306G336E337F339NI/L/V/F/CL/F/CI/L/S/V/MG/A/VD/E/S/N/H/TF/CNA(по Canaveset.al, [24])123Окончание таблицы 6.230Область отсутствия видимой гомологии междутипами доменовС-спираль1-ый2-ойβ2кэпB-спиральβ1ост.ост.Область гомологии между типами доменовФСКг/пфакторы транскрипциибелокG74L75F76NF102I106N109P110–R123*S82I83A84NL109I113R116P117–R130G76L77F78NF107S111D114S115–R128S99M100I101NL126L130M133P134–R151*S78L79L80NY105I109L112P113–R126S85I86F87NL112V116H119P120–R133EPAC2–I117L118NF143W147Y150R151–A300L301I302YF327C331S334P335–R348C584L585L586YF611L615Y618P619–R632C611L612L613YF638L642Y645P646–R659C662L663L664YF689L693Y696P697–R710C531L532L533YF558L562Y565P566–R579C613L614L615YF640L644F647P648–R661A407L408V409YF435L439R440–D441–L449*A202L203I204YY229L233M234–G235–A206L207M208YF233I237V238–K239–A223L224M225YF250I254V255–K256–A251L252M253YF278L282L283–G284–ALI/M/LYY/FL/I/VM/V/–G/D/–HCNCNGА-домены ПКАEPAC2B-домены ПКАL/F/KK/EA326L327L328YF353L357––G358P359N367Y371A336L337V338YF363L367––G368P369N377Y381A352L353V354YF379L383––G384P385N393Y397A370L371L372YF397L401––G402P403N411?P413*ALL/V/IYFL/M/C––GP/NN/D/M/Y/ –/I30–Q/ –Каждый тип домена выделен своим цветом: первый – оранжевым, второй – сиреневым, третий – оливковым.Область гомологии между доменами показана светлыми тонами, область отсутствия видимой гомологии – болеетемными, а аминокислотные остатки, формирующие излом,– самыми темными.
В столбцах э/п и г/п(электростатический и гидрофобный «переключатели») «N» обозначает их отсутствие, «Y» - наличие, а «NA»означает отсутствие данных по этому вопросу. Звездочкой отмечены те аминокислотные остатки кэпа, которые негомологичны остальным аминокислотным остаткам, формирующим кэп в этом типе доменов. Аминокислотныеостатки, не существующие в рассматриваемом домене, отмечены прочерком.
Пустыми оставлены ячейки,отведенные под аминокислотные остатки, не играющие, на наш взгляд, существенной роли в конформационномпереходе рассматриваемого домена.124А.Б.Г.В.Д.А – Первый тип цАМФ-связывающих доменов на примере CNG канала. Б – Второй тип цАМФ-связывающихдоменов на примере А домена ПКА Iα (H-конформация). В – Второй тип цАМФ-связывающих доменов на примереА домена ПКА Iα (B-конформация). Г – Третий тип цАМФ-связывающих доменов на примере B домена ПКА Iα(H-конформация). Д – Третий тип цАМФ-связывающих доменов на примере B домена ПКА Iα (B-конформация).Синими сферами выделены участки, где расположены аминокислотные остатки, образующие шарнир или излом.Рисунок 6.8 – Типы цАМФ-связывающих доменов6.6. Промежуточные выводы1) Показаны цАМФ-индуцированные переходы из H- в В-конформацию для тринадцатинезависимых А-доменов ПКА Iα, один из которых содержит мутационную замену R209K.
Озавершенности переходов судили по изменению RMSD доменов в целом и их надвторичных125структур (ФСК, N3A-мотива, B/C-спирали).2)КонформационныйпереходА-доменазапускаетсяэлектростатическим«переключателем», представленным цепочкой цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O). В ответ насвязывание лиганда амидная группа A202 переключается с карбонильной группы G199 на атомкислорода О6 фосфатной группы цАМФ и этим запускает череду событий, приводящих вконечном итоге к достижению B-конформации.3) Подтверждены выводы предыдущих глав о непричастности электростатического«переключателя» R209–D170–R226 к конформационному переходу А-домена.4)Срабатываниеэлектростатического«переключателя»цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O) является механизмом, который передает сигнал о связывании лиганда нагидрофобный «переключатель» L203–Y229.
Сигнал передается через упаковывание боковойцепи L203 в гидрофобный карман.5)ДвижущейсилойповоротаB/C-спираливрамкахработыгидрофобного«переключателя» является на первых этапах сохранение взаимодействия между Y229 и L203, азатем повышение энергии взаимодействия Y229 с β-субдоменом в целом.6) В А-домене ПКА Iα поворот B/C-спирали невозможен без смещения N3A-мотива, таккак в этом и ряде других цАМФ-связывающих доменов N3A-мотив в H-конформации и B- и Сспирали в B-конформации занимают одну и ту же область пространства.7) Помимо гидрофобного «переключателя», существуют и другие гидрофобныевзаимодействия, которые играют важную роль в конформационном переходе А-домена(например, взаимодействие L233 с N3A-мотивом, приводящее к появлению витка π-спирали).8) На основании полученных результатов переход А-домена из H- в В-конформациюможно представить в виде трех последовательных этапов. На первом этапе в ответ насвязывание лиганда B-конформацию принимает ФСК.
На втором этапе, благодаря смещениюN3A-мотива и упаковыванию боковой цепи L203 в гидрофобный карман, образованный β2β3петлей, поворачивается B/C-спираль, а в ее структуре, вследствие стремления остатков L233 иM234 к более выгодному гидрофобному окружению, формируется виток π-спирали. На третьемзаключительном этапе в результате сближения боковых цепей R241 и E200 на месте витка πспирали образуется излом, который разделяет B/C-спираль на отдельные B- и С-спирали. Этасхема является первым приближением к пути минимальной свободной энергии (ПМСЭ) междуH- и В-конформациями А-домена ПКА Iα. Ее уточнение и построение профиля свободнойэнергии вдоль уточненного ПМСЭ входит в планы наших дальнейших исследований.126ЗАКЛЮЧЕНИЕХарактеристика перехода А-домена RIαα из H- в В-конформацию с позиций теорийиндуцированного соответствия и отбора конформацийС использованием метода докинга мы показали, что цАМФ-связывающий сайт А-доменаRIα доступен для лигандов, даже если R-субъединица связана с С-субъединицей иподдерживает ее неактивное состояние.
Для обоих агонистов (цАМФ и Sp-цАМФS) и обратногоагониста Rp-цАМФS свободная энергия связывания с А-доменом, независимо от егоконформации, оказалась существенно меньше нуля. Тем не менее с А-доменом в Bконформации все три лиганда формировали более устойчивые комплексы.Такие результаты, в совокупности с экспериментально показанным увеличениемскорости диссоциации R- и С-субъединиц в присутствии агонистов, говорят в пользунепосредственного участия цАМФ и Sp-цАМФS в переходе А-домена из H- в В-конформацию,то есть указывают на преимущественное протекание активации ПКА Iα по путииндуцированного соответствия.МеханизмобратногоагонизмаRp-цАМФS,всоответствиисприведеннымирезультатами, также должен заключаться не в отборе H-конформации А-домена, а вблокировании его перехода в В-конформацию. Этот факт имеет важнейшее значение дляобъясненияначальныхэтаповмеханизмацАМФ-индуцированныхконформационныхизменений А-домена.цАМФ запускает переход А-домена RIαα из H- в В-конформацию посредствомэлектростатического «переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O)Полученные нами данные позволили выделить электростатический «переключатель»цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), посредством которого цАМФ передает информацию освоемсвязываниинагидрофобный«переключатель»L203–Y229иэтимзапускаетконформационный переход А-домена.
Амидная группа A202 переключается с карбонильнойгруппы G199 на атом кислорода О6 фосфатной группы цАМФ, что сопровождается смещениемискомой амидной группы на расстояние около 2,5Å. Этот процесс приводит к переходу B`спирали ФСК из 310- в α-форму и, как следствие, к упаковыванию боковой цепи L203 вгидрофобныйкарман,образованныйβ2β3-петлей.Последнеесобытиеинициируетконформационные изменения, положенные Хольгером Рехманном [30, 33] в основугидрофобного переключателя L203–Y229.Ключевая роль электростатического переключателя цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O) впереходе А-домена из H- в В-конформацию находит подтверждение в предложенном нами127механизме функционирования Rp-цАМФS в качестве обратного агониста ПКА Iα.
Согласнополученным в ходе исследования данным Rp-цАМФS, находясь в цАМФ-связывающем сайте,препятствует смещению амидной группы A202, в результате чего А-домен оказываетсяблокированным в H-конформации.Электростатический «переключатель» R209–D170–R226 не задействован в переходеА-домена RIαα из H- в В-конформациюПроведенное исследование показало, что известный по литературным даннымэлектростатический «переключатель» R209–D170–R226 [5, 32, 65, 105] не задействован вконформационном переходе А-домена из H- в В-конформацию. В пользу отсутствия у неготакой функции свидетельствуют: а) переход в В-конформацию домена с мутационной заменойR209I; б) восстановление способности домена с мутацией R209K к H→B конформационномупереходу как результат фиксации положения β2β3-петли и боковой цепи K209; в) отсутствиеискомого«переключателя» вовсехцАМФ-связывающихдоменах,кромеА-доменовпротеинкиназ А.Согласно нашим представлениям, роль электростатического «переключателя» R209–D170–R226 сводится к дополнительной стабилизации B- и Н-конформаций А-домена спомощью водородных связей R209–D170 и R226–D170 соответственно.Роль остатка R209 в активации ПКА IααНесмотря на то, что электростатический «переключатель» R209–D170–R226 незадействован в переходе А-домена из H- в B-конформацию, R209 является инвариантнымостатком, и замена его на близкий по свойствам лизин повышает константу активации ПКА Iαболее чем на порядок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
