Диссертация (1145986), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Экспериментальных оценок этой константы, не существует, нополученное значение представляется правдоподобным, так как выполняется неравенствоKd 3AB ≤ Kd 3 B . Выполнение этого неравенства согласуется с экспериментально измереннымзначением коэффициента Хилла (h = 1) для свободной регуляторной субъединицы RIα сделецией ∆(1–91) [79].6) Kd 2 A = 6,5 ⋅10 −8 М .
Экспериментальных оценок этой константы, не существует, но данноезначение представляется правдоподобным, так как оно больше рассчитанного намизначения Kd2 для комплекса RABC R333K (3,1·10-8М) и несколько меньше значения Kd2 длякомплекса RAC (6,7·10-8М). Согласно данным, полученным методом поверхностногоплазмонного резонанса, мутация R333K значительно [76] и присутствие B-доменанезначительно [65, 69, 35] повышают стабильность RC комплекса.7) Kd 2 B = 5,8 ⋅ 10 −9 М .
Экспериментальных оценок этой константы, не существует, но данноезначение представляется правдоподобным, так как оно больше рассчитанного намизначения Kd2 для комплекса RABC R209K (1,9·10-9М). Согласно данным, полученнымметодом поверхностного плазмонного резонанса, мутация R209K значительно повышаетстабильность RC комплекса [69].8) Наши приближенные оценки истинных констант связывания цАМФ с R-субъединицей иRC комплексом дали следующие значения: KdR ≈ 2,7·10-8М, KdRC ≈ 1,2·10-6М. При этомзначение KdR находится в хорошем соответствии с экспериментальными данными(таблица 1.1), а значение KdRC более чем в 2 раза меньше экспериментально измеренного(таблица 1.1).
Тем не менее вследствие приведенных в разделе Б.2.1 причин, мы не будемпридавать этим оценкам большого значения.170Таблица Б.2 – Значения констант, характеризующих активацию ПКА Iα с двумя доступнымидля лиганда сайтами связыванияКонстантаЗначение, MИсточник значения константыKdR≈2,7·10-8Оценена в разделе Б.2-6Оценена в разделе Б.2KdRC≈1,2·10Kd1A4,0·10-5Оценена в разделе Б.1.9.1KdB1A2,4·10-6Оценена в разделе Б.2Kd1B6,0·10-7Эксперимент (таблица 1.1)KdA1B3,5·10-8Оценена в разделе Б.2Kd22,5·10-7Эксперимент (таблица 1.1)Kd2A6,5·10-8Оценена в разделе Б.2Kd2B5,8·10-9Оценена в разделе Б.2Kd3A7,8·10-8Оценена в разделе Б.1.9.3KdB3A5,6·10-8Эксперимент (таблица1.1)-8Оценена в разделе Б.1.9.4Kd3B1,3·10KdA3B9,2·10-9Оценена в разделе Б.2Kd41,25·10-10Оценена в разделе Б.2Kакт/[C]tot9,8·10-8/2,5·10-8Оценена в разделе Б.2171ПРИЛОЖЕНИЕ ВВ приложении В представлены результаты факторного и кросскорреляционногоанализов, полученные для конформационного (H→B) перехода А-домена ПКА Iα всоответствии с методикой, изложенной в разделе 3.4.3.
На рисунках В.1 – В.12 приведеныданные для домена дикого типа (опыты 1 – 12), а на рисунке В.13 – для домена с точечнойзаменой R209K.Таблицы для всех опытов построены по единому принципу. В столбцах приведеныфакторы, описывающие основные конформационные изменения белка, в порядке следования вовремени соответствующих им стадий.
В строках даны параметры, на совокупности которыхделался факторный анализ (о выборе параметров в разделе 2.4.3). Вклады параметров вфакторы выделены жирным шрифтом, если соответствующие изменения значений параметровне являются случайными и по модулю таковы, что ими нельзя пренебречь. Вклады, меньшиечем 0,35, в таблице не приведены. Названия и вклады параметров, значения которых припереходе в В-конформацию уменьшаются, выделены синим цветом, а значения которыхувеличиваются–красным.Единственныйпараметр,значениякотороговходеконформационного перехода сначала уменьшаются, а потом увеличиваются – расстояние,характеризующее водородную связь между амидной группой R230 и карбонильной группойG235.
Название этого параметра выделено лиловым цветом, а вклады синим и красным всоответствии с принятыми нами обозначениями.Цветными блоками показаны события, совокупность которых и описывает переходдомена из H- в В-конформацию. Каждое событие независимо от опыта характеризуетсяотносительно постоянным набором параметров, вносящих вклады в него, с фиксированным длякаждого параметра знаком. При этом одни и те же параметры на разных стадияхконформационного перехода могут вносить вклад в разные события, а один фактор может бытьобразован более чем одним событием. Голубым цветом отмечено событие А, строго говоря, неимеющее отношения к переходу домена в В-конформацию. Это восстановление водородныхсвязей спирали ФСК после устранения деформирующего влияния С-субъединицы.
Серымцветом выделено событие Б – переход ФСК из H- в В-конформацию, включая «упаковывание»боковой цепи L203 в гидрофобный карман (процессы, подробно описанные в главах 5 и 6).Сиреневым цветом показано движение N3A-мотива в сторону от ФСК (событие В), а желтымцветом – поворот B/C-спирали (событие Г). Элементом гидрофобного переключателя являетсяобразование взаимодействия между Y229 и β-субдоменом. Соответствующее этому процессусобытие Д отмечено розовым цветом. Зеленым цветом показан продемонстрированный намипереход фрагмента B/С-спирали из α- в π-форму и сопутствующее ему увеличение энергии172взаимодействия B/С-спирали с ФСК и N3A-мотивом (событие Е). π-спирали в белках являютсяпереходными недолговечными структурами.
Событие И, заключающееся в образовании изломаB/C-спиралинаместеπ-спирали,фрагментаатакжевфиксацииэтогоизломаэлектростатическим взаимодействием R241–E200 и в меньшей степени вандерваальсовымвзаимодействием L238–I204, обозначено темно-бирюзовым цветом.Этапы34№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)1210,8040,855-0,730,840,703-0,791-0,7420,767E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации20,8740,42225,2310,438-0,4370,359-0,4290,4310,829-0,862-0,852-0,6140,928-0,8480,869-0,6940,8660,8610,6070,620,3980,870,91939,6164,840,439-0,6820,803-0,414-0,775-0,861-0,913-0,9160,9370,7620,8460,71428,9828,98Рисунок В.1 – А-домен дикого типа (опыт 1)34Разделение процесса конформационного перехода на этапы здесь и далее (на рисунках в приложении Г) являетсятехническим приемом (подробнее раздел 2.4.3) и для каждого опыта различно.173Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации110,5260,7340,728-0,680,6570,725-0,6-0,6060,592-0,755-0,691-0,8122210,5170,4270,36-0,412-0,4090,5690,721-0,464-0,533-0,3720,848-0,6390,3520,840,8680,77-0,489-0,933-0,9260,77-0,942-0,910,9530,8560,7840,6850,68631,610,3980,5310,52523,0954,70Рисунок В.2 – А-домен дикого типа (опыт 2)0,3970,8336,4425,3631,80174Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)110,3540,8120,678-0,6820,371-0,667-0,6340,567-0,492220,72621-0,5660,356-0,6650,4850,6410,682-0,666-0,936-0,8090,954-0,8690,898-0,8820,8020,9440,7980,836Σ% вариации0,6960,72917,2510,689E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариации30,43913,2230,47Рисунок В.3 – А-домен дикого типа (опыт 3)-0,386-0,895-0,903-0,959-0,9010,8830,8630,456,920,9090,89537,0944,010,70822,3322,33175Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)1120,9210,8780,791-0,7520,5750,652-0,731-0,8130,719-0,676Σ% вариации3110,4210,716-0,455-0,3690,355-0,577-0,716E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариации2-0,417-0,5150,756-0,71-0,718-0,7760,928-0,8080,833-0,8430,8690,8340,490,8250,3726,730,4730,5020,79716,8443,57Рисунок В.4 – А-домен дикого типа (опыт 4)0,929-0,4150,725-0,924-0,915-0,463-0,949-0,9090,9490,83929,820,8950,62529,1929,8229,19176Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации1250,6581210,8530,864-0,8160,7650,81-0,897-0,7260,892-0,7250,6580,381-0,550,599-0,873-0,862-0,626-0,4131,8038,69Рисунок В.5 – А-домен дикого типа (опыт 5)0,616-0,411-0,6460,897-0,8610,86-0,7580,7920,8310,368-0,3640,9580,4111-0,587-0,7596,8930,7870,87419,47-0,36-0,944-0,9410,3670,638-0,957-0,9130,9290,8080,4850,91524,4824,7543,9524,75177Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)140,85750,4950,431-0,4022120,8750,902-0,8570,6760,678-0,92-0,8060,9140,577-0,4810,631E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации1-0,4420,4190,781-0,902-0,898-0,3950,3580,4520,5710,917-0,8350,87-0,8130,8170,8550,750,696-0,3567,225,9346,57Рисунок В.6 – А-домен дикого типа (опыт 6)0,9540,75-0,59133,421-0,4380,7-0,5430,8030,87520,060,53824,6244,68-0,504-0,961-0,955-0,96-0,9030,8920,5580,9330,43726,5126,51178Этапы1№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)50,717E (Y229/L135,F136)-0,58Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации0,41112212-0,370,3986,23-0,3780,809-0,6590,768-0,690,6730,81-0,841-0,887-0,4880,368-0,37845,76Рисунок В.7 – А-домен дикого типа (опыт 7)2-0,501-0,351-0,956-0,902-0,953-0,8410,894-0,44126,8510,614-0,4320,684-0,814-0,7550,9250,5674-0,680,8220,795-0,7490,5960,774-0,865-0,7940,8370,36730,718-0,5160,6590,58512,680,35918,320,7570,86317,2535,570,9220,36823,0023,00-0,56-0,790,8339,639,63179Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации1220,7660,6391210,8740,776-0,8190,4580,771-0,867-0,8340,825-0,7590,3860,6380,543-0,6650,816-0,904-0,935-0,8720,385-0,51-0,58730,5860,375210,729-0,358-0,7350,897-0,8270,775-0,7910,8930,812-0,409-0,908-0,9-0,939-0,8090,9030,7270,7169,950,9280,846-0,74536,8246,77Рисунок В.8 – А-домен дикого типа (опыт 8)0,8320,80820,950,4140,49323,3344,28-0,404-0,570,8720,4186,8724,3931,26180Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)160,95712Σ% вариации341110,9150,892-0,8850,7060,894-0,927-0,8790,9290,3620,853-0,725-0,403-0,825-0,897E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариации20,6440,360,707-0,4630,894-0,7240,825-0,7880,7180,770,713-0,519-0,49-0,506-0,428-0,4070,5020,6184,570,9640,7370,54239,4552,22Рисунок В.9 – А-домен дикого типа (опыт 9)0,488,20-0,396-0,607-0,723-0,969-0,933-0,466-0,965-0,8760,6960,50,5610,5920,510,7210,87519,310,81220,5119,3124,4224,42181Этапы1№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)60,932E (Y229/L135,F136)-0,36Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариацииΣ% вариации0,5152152120,506-0,761-0,5130,7210,3890,5-0,457-0,748-0,6130,5850,518-0,405-0,5190,907-0,8290,813-0,8370,8490,823-0,704-0,417-0,928-0,943-0,6076,300,9290,7410,54634,7060,23Рисунок В.10 – А-домен дикого типа (опыт 10)10,4480,880,895-0,8630,690,837-0,876-0,8670,9070,51336,310,3550,730,705-0,6430,5380,64912,920,6040,4325,210,6050,4588,6733,88-0,963-0,940,930,6220,93924,6624,66182135Этапы№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)50,9090,667212613Σ% вариации2-0,3730,5710,849-0,86-0,866-0,37-0,4090,449-0,746-0,728-0,5440,912-0,740,614-0,4240,7620,7810,9120,53722,880,5740,8139,4345,836,710,433-0,902-0,858-0,914-0,7470,8410,350,6086,8110,8410,853-0,8330,5830,564-0,855-0,6890,859E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариации30,6740,81219,1026,400,4290,5167,3016,900,7147,0123,91Рисунок В.11 – А-домен дикого типа (опыт 11)35Порядок следования стадий на первом этапе опыта 11 определен визуально, так как из-за колебаний значенийпараметров кросскорреляционный анализ давал неудовлетворительные результаты183Этапы1№ фактораL201(O)–Y205(N)L201(N)–цАМФA202(N)–цАМФG199(O)–A202(N)E200(O)–I204(N)A202(O)–T207(N)G169(N)–G206(O)G169(N)–T207(O)E (L203/G169,D170,N171)E (Y229/F172,E200,L203,I204)E (L203,I204/L135,F136)L135(Cαα)–I204(Cαα)E (Y229/L135,F136)Y229(O)–M234(N)R230(O)–M234(N)R230(O)–G235(N)R231(O)–G235(N)E (L233/L135,F136,L139)E (M234/I204)R231(O)–S236(N)I232(O)–S236(N)E (R241/E200)E (L238/I204)RMSDB(ФСК)RMSDB(B/С-h)RMSDB(N3A)% вариации20,8490,555-0,406-0,783Σ% вариации451110,420,654-0,4210,3830,866-0,733-0,352-0,6990,7480,48-0,701-0,489-0,882-0,5140,4160,545-0,7810,8840,7740,787-0,669-0,521253210,7350,9090,897-0,8680,6630,896-0,9-0,866-0,788-0,5260,8960,378-0,8160,660,474-0,392-0,6920,939-0,8530,797-0,7280,5360,8390,731-0,921-0,880,482-0,6260,407-0,953-0,8980,9040,7650,5589,770,9280,684-0,63740,480,847-0,4818,268,0458,5125,0133,050,7310,57411,9313,9125,840,3610,7130,85118,940,8610,64125,9218,9425,92Рисунок В.12 – А-домен дикого типа (опыт 12)3636В ходе данного опыта событие Е происходит раньше событий В и Д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
