Диссертация (1145911), страница 18
Текст из файла (страница 18)
При этом уровни фрагментации ДНК сперматозоидов пациентов с Ти нормозооспермией, установленными согласно ВОЗ 2010 года, не отличались. Такимобразом,болеестрогиекритерииоценкиморфо-функциональныххарактеристиксперматозоидов в большей степени отражают качество гамет и при выборе наиболееоптимального метода оплодотворения при применении ВРТ следует руководствоватьсянормативами ВОЗ 1999 года. Возможно, новые референсные значения, принятые ВОЗ в 2010году,вбольшейстепениподходятдляанализаоплодотворяющейспособностисперматозоида in vivo.Возможно, что некоторые морфологические особенности сперматозоида могутотражать состояние его генома.
Так, например, показано, что большая головкасперматозоида ассоциирована с увеличением плоидности его генома (Федорова и др, 2005;Vicari et al., 2003; Machev et al., 2005). Изучение взаимоотношений между наследственнымаппаратом клетки и ее фенотипом является не только одной из основных задач 88 фундаментальной генетики, но и представляет большой практический интерес в связи сбурным развитием вспомогательных репродуктивных технологий, где при использованииметода ICSI выбор сперматозоида для оплодотворения в большей степени основывается наего морфологических характеристиках. При этом предпочтение отдается сперматозоидам снормальнойморфологиейилинезначительнойпатологией.Однаковслучаетератозооспермии, когда в эякуляте преобладают только патологические формы, вопросвыбора сперматозоида встает особенно остро.Исходя из вышеизложенного, мы проанализировали уровень фрагментации ДНК упациентов, в эякуляте которых преобладали аморфные, грушевидные, вакуолизированныеили сперматозоиды с патологией акросомы.
Наибольшая доля сперматозоидов сфрагментированной ДНК была выявлена при доминировании вакуолизированной формыголовки и между данными показателями была выявлена взаимосвязь. Кроме этого изнативных образцов эякулята при помощи микроманипуляционного оборудования былиотобраны индивидуальные сперматозоиды с вакуолизированной и нормальной головками,для которых впоследствии был проведен анализ фрагментации ДНК, в результате которогобыло выявлено, что уровень фрагментации ДНК сперматозоидов с вакуолизированнойголовкой выше такового сперматозоидов с нормальной головкой.
О происхождениивакуолей нет единого мнения. Вакуоли могут быть образованы такими мембраннымиструктурами головки как ядро или акросома (Gatimel et al., 2013; Fekonja et al., 2014). Помнению ряда авторов, вакуоли являются результатом нарушения компактизации хроматина.Такая вакуоль представляет собой полость, или место скопления деконденсированногохроматина. С наличием вакуолей в головке сперматозоида связывают нарушениесоотношения гистонов и протаминов (Chemes and Rawe, 2003; Bartoov, 2003; Boitrelle, 2011).Таким образом, было показано, что вакуолизированная форма головки сперматозоидаявляется морфологическим маркером нарушения целостности его ДНК. Также исходя изполученныхданныхможнопредположить,чтонарушениягеномасперматозоидасказываются на его морфологии.
И, возможно, преобладание в эякуляте тех или иных редковстречающихся в норме форм головок будет связано с какими-либо нарушениями геномаили эпигенома сперматозоида. Дальнейшей перспективой могут стать исследованиядинамических изменений как уровня фрагментации ДНК, так и его морфологическогомаркера в ответ на внешние воздействия, например, прием витаминов и антиоксидантов.Известно, что прием антиоксидантов снижет уровень фрагментации ДНК сперматозоидов(Greco et al., 2005).Вопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на ключевые этапы раннегоэмбрионального развития остается открытым. Большинство исследователей сходится во 89 мнении, что фрагментация ДНК сперматозоидов не снижает эффективности оплодотворения(Tomlinson et al., 2001; Henkel et al., 2003; Henkel et al., 2004; Velez de la Calle et al., 2008) .Другие, напротив, считают, что при повышении уровня фрагментации ДНК сперматозоидовэффективность оплодотворения снижается (Høst et al., 2000; Huang et al., 2005).
В настоящейработе было показано, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидовэффективность оплодотворения не снижается. При этом, мы учитывали эффективность нетолько в группах пациентов, различающихся по уровню фрагментации ДНК сперматозоидов,но в зависимости от способа оплодотворения. Так, можно предположить, что приоплодотворении методом ЭКО, максимально приближенному к условиям оплодотворения invivo, эффективность должна быть ниже, поскольку сперматозоиды с фрагментированнойДНК, при условии, что фрагментация обусловлена действием АФК, должны двигатьсямедленнее вследствие перекисного окисления липидов плазматической мембраны. Вместе стем при оплодотворении методом ICSI, или внутрицитоплазматической инъекциисперматозоида, эффективность должна быть выше.
Тем не менее в нашем исследованиибыло показано, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидовэффективность оплодотворения, вне зависимости от его метода, не снижается.Нет единого мнения и о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на развитиеэмбрионов. Так, считается, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидовкачество эмбрионов, культивируемых in vitro, снижается (Gandini et al., 2004; Seli et al., 2004;Velez de la Calle et al., 2008). Однако существует и альтернативное мнение по данномувопросу (Henkel et al., 2004; Bakos et al., 2008). Полученные в настоящем исследованииданные свидетельствуют в пользу первого. Так, было показано, что между уровнемфрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте пациентов, направленных на процедуру ЭКОили ЭКО с ICSI, и качеством эмбрионов, полученных в данных протоколах, существуетвзаимосвязь.
При этом, чем больше доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК вэякуляте, тем хуже качество культивируемых in vitro эмбрионов. Вероятнее всего, что частьразрывовДНКсперматозоидарепарируетсяферментамиооцитавскорепослеоплодотворения до стадии 4-8 клеток, когда происходит зиготическая трансформация (MZT,maternal to zygotic transformation) (Braude et al., 1988; Ménézo et al., 2010). В то время какнерепарированные разрывы ДНК сперматозоида приведут к нарушению работы геномаэмбриона и остановке развития на ранних этапах эмбриогенеза.Окислительныйстресстакжеявляетсяпричинойнарушенияэпигеномасперматозоида.
Показано, что в результате действия АФК уровень метилирования ДНКсперматозоида меняется (Tunc and Tremellen, 2009). Так, результатом окислительногостресса является активное деметилирование ДНК, в ходе которого происходит превращение 90 5-метилцитозина в цитозин (Aitken et al., 2013). При этом, в ходе последовательныхбиохимических реакций образуются кислородсодержащие соединения, в том числе 5гидроксиметилцитозин (Doshi et al., 2011). Открытым остается вопрос о роли 5гидроксиметилцитозина в сперматогенезе (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010).
Некоторыеисследователи отмечают неслучайное распределение данного соединение в геномесперматозоида,чтосвязываютсактивностьюгенов,необходимыхдляраннегоэмбрионального развития (Gan et al., 2013). Следовательно 5-гидроксиметилцитозин долженприсутствовать во всех или в большинстве сперматозоидов. Интересно отметить, что внастоящем исследовании было показано, что, в отличие от 5-метилцитозина, 5гидроксиметилцитозин содержался лишь в единичных сперматозоидах. При этом долясперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин, варьировала как в эякуляте доноровспермы, так и в эякуляте пациентов с аномалиями кариотипа. Что вероятнее всегообусловлено действием экзогенных факторов.
Поэтому, мы проанализировали соотношениеуровня фрагментации ДНК и уровня ее гидроксиметилирования в сперматозоидах пациентовс нарушением фертильности и выявили корреляцию между данными параметрами. Так,возможно, причиной появления 5-гидроксиметилцитозина является действие АФК,образующихся в результате окислительного стресса в ответ на действие неблагоприятныхфакторов окружающей среды. В свою очередь, появление 5-гидроксиметилцитозина врезультате активного деметилирования 5-метилцитозина приводит к деконденсациихроматина сперматозоида, что делает его ДНК более доступной для атаки АФК.
Такимобразом, высокий уровень фрагментации ДНК ассоциирован с высоким уровнемгидроксиметилирования ДНК. И, можно предположить, что нарушение целостности геномасперматозоида отражает нарушение эпигенома. 91 ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящем исследовании установлено, что около 11% пациентов с нарушениемфертильности являются носителями числовых и структурных аномалий кариотипа. Приэтом, для таких пациентов характерно варьирование как уровня фрагментации ДНКсперматозоидов, так и параметров спермиологического анализа, от нормальных допатологичных.
Таким образом, не все аномалии кариотипа сопровождаются нарушениемсперматогенеза. Тем не менее, у носителей числовых и структурных нарушений повышеначастота образования несбалансированных гамет, которые могут принять участие воплодотворении,увеличиваявероятностьпоявленияэмбрионовсхромосомнымдисбалансом.В настоящем исследовании было показано, что нарушением фертильности в 70%случаев обусловлено снижением показателей спермиологического анализа, проведенного всоответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% - в соответствии с нормативами ВОЗ1999 года. Кроме того, было показано, что более строгие критерии оценки морфофункциональных характеристик сперматозоидов наиболее точно отражают качество гамет.Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте пациентов с нарушениемфертильности показал, что для пациентов со сниженным содержанием морфологическинормальных сперматозоидов характерен высокий уровень фрагментации их ДНК.
При этом,прианализефрагментацииДНКсучетомморфологииголовокбылвыявленморфологический маркер нарушения целостности ДНК – вакуолизированная головкасперматозоида.Крометого,былопоказано,чтоизмененияцелостностигеномасперматозоида отражают изменения эпигенома: высокий уровень фрагментации ДНКсоответствует высокому уровню содержания гидроксиметилированных сперматозоидов вэякуляте.В настоящей работе было показано, что фрагментация ДНК сперматозоида неснижает эффективности оплодотворения, но в то же время приводит к нарушению развитияэмбрионов, культивируемых in vitro.Таким образом, результаты настоящего исследования вносят существенный вклад впонимание взаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов иструктурно-функциональнымиОхарактеризованныевработеиэпигенетическимиморфологическиеособенностямимаркерыихгенома.сперматозоидапозволятосуществлять направленную селекцию клеток, используемых для оплодотворения с целью 92 повышения его эффективности и вероятности развития нормальных эмбрионов.
Результатыпроведенногоисследованиямогутбытьиспользованыдляразработкиалгоритмаобследования пациентов с нарушением фертильности, что особенно актуально для пар,прошедших ряд неудачных попыток ЭКО. 93 ВЫВОДЫ 1. Около 11% мужчин с нарушением фертильности являются носителями числовых иструктурных аномалий кариотипа.2. Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно дляпациентов со сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов.3. Вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическиммаркером нарушения целостности ДНК.4.
Для пациентов с аномалиями кариотипа характерен как широкий диапазонварьированиявсехпараметровспермиологическогоанализа,такиуровняфрагментации ДНК сперматозоидов.5. У пациентов с нарушением фертильности высокая доля сперматозоидов сфрагментированной ДНК сочетается с высокой долей сперматозоидов с 5гидроксиметилированной ДНК.6. Нарушениецелостностиоплодотворения,нокультивировании in vitro.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
