Автореферат (1145910)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

На правах рукописиШильникова Евгения МихайловнаГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМАСПЕРМАТОЗОИДА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕРАЗВИТИЕ ЧЕЛОВЕКАспециальность 03.02.07 – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20152Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательномучреждениивысшегопрофессиональногообразования«Санкт-Петербургскийгосударственный университет» и в Федеральном государственном бюджетном научномучреждении «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии ирепродуктологии имени Д.

О. Отта».Научный руководитель:Член-корр. РАН, з.д.н., д.м.н., профессорВладислав Сергеевич Баранов, заведующийлабораторией пренатальной диагностикинаследственных и врожденных заболеванийчеловека ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О. Отта»Официальные оппоненты:Доктор биологических наук, профессорЕвгений Львович Паткин, заведующийлабораторией молекулярной цитогенетикиразвитиямлекопитающихФГБНУ«Институт экспериментальной медицины»(г.Санкт-Петербург)Кандидат медицинских наук ВячеславБорисович Черных, старший научныйсотрудник лаборатории генетики нарушенийрепродукции ФГБНУ «Медико-генетическийнаучныйцентр»(г.Москва)Ведущее учреждение: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинскойгенетики», г. ТомскЗащита диссертации состоится «» ____________ 2015 г.

вчасов на заседаниисовета Д 212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при СанктПетербургском Государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург,Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики ибиотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургскогогосударственного университета (http://spbu.ru/).Автореферат разослан «» _______________ 2015 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.232.12доктор биологических наукЛюдмила Андреевна Мамон3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования и степень разработанностипроблемыСперматогенез человека – сложный многоэтапный процесс, врезультате которого путем последовательных делений и преобразований издиплоидных клеток формируются высокоспециализированные гаплоидныеполовые клетки – сперматозоиды, основной функцией которых являетсяхранение и транспортировка наследственной информации.

К изменениюморфо-функциональных характеристик сперматозоидов и структурнофункционального состояния их генома могут приводить возникающие налюбомизэтаповсперматогенезанарушения,вызванныекакнаследственными, так и экзогенными факторами.Среди наследственных факторов выделяют нарушения кариотипа, втом числе числовые и структурные аномалии. Хромосомные перестройкинарушают процесс нормальной конъюгации и синапсиса хромосом, чтоприводит к блоку сперматогенеза, и, соответственно, снижениюспермопродукции. В то же время у носителей структурных аномалийкариотипа повышена частота образования несбалансированных гамет,которые могут принять участие в оплодотворении, увеличивая вероятностьпоявления эмбрионов с хромосомным дисбалансом. Другой причинойснижения фертильности у мужчин являются микроделеции хромосомы Y влокусе AZF. Продукты более 2000 генов обеспечивают дифференцировку исозревание мужских половых клеток.

Установлено, что от 10% до 50%случаев нарушения сперматогенеза вызвано изменениями кариотипапациента и/или мутациями отдельных генов (Ferlin, 2012).Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играютнеблагоприятные факторы внешней среды, курение, ожирение, стресс,которые приводят к образованию активных форм кислорода (АФК) в клетке.Последние, в свою очередь, напрямую связаны с процессом активногодеметилирования ДНК, являющегося одним из основных эпигенетическихмеханизмов регуляции функции генов. В процессе активногодеметилирования происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин.

Приэтом в ходе последовательных биохимических реакцийобразуютсякислородсодержащие производные 5-метилцитозина, в том числе 5гидроксиметилциозин. Для изучения гидроксиметилирования ДНКразработанрядподходов,однимизкоторыхявляетсяиммуноцитохимическая детекция 5-гидроксиметилцитозина с помощьювысокоспецифичных антител. Использование иммуноцитохимическогоподхода для оценки эпигенетического статуса генома особенноцелесообразно при работе с отдельными клетками, в том числе половыми.Другой мишенью АФК является ДНК половых клеток. Действительно,20% случаев идиопатического бесплодия обусловлено нарушениемцелостности ДНК сперматозоидов (SCSA, 2005). Одним из основныхметодов оценки фрагментации ДНК сперматозоидов является метод4флуоресцентного мечения одно- и двунитевых разрывов ДНК (TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling).Фрагментация ДНК сперматозоида влияет на первые деления дроблениязародыша, частоту имплантации и наступления беременности (Shamsi et al.,2008).

Вероятно, нарушение целостности ДНК сперматозоида можетприводить к изменению его морфологии. В связи с этим, изучениевзаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов иструктурно-функциональными и эпигенетическими особенностями их геномаявляется актуальным. Выявление такой взаимосвязи важно длянаправленного отбора сперматозоидов в условиях искусственногооплодотворения и реализации программ вспомогательных репродуктивныхтехнологий.

Тем более что нарушение сперматогенеза - одна из основныхпричин бесплодия, частота которого во многих странах, в том числе и вРоссии, достигает 15% (WHO, 2010). При этом вклад мужского фактора вэтиологию бесплодия составляет 50-60% (WHO, 2010), и в последниедесятилетия отмечается снижение основных показателей спермограммы –концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов (Slama et al.,2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013).В связи с этим цель настоящего исследования – оценить взаимосвязьмеждуморфо-функциональнымихарактеристикамисперматозоидов,целостностью их ДНК и уровнем ее гидроксиметилирования, а такжеэффективностью оплодотворения, способностью к развитию эмбрионов,полученных от пациентов с нормальным и аберрантным кариотипами.В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:1.

Провести анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности.2. ПровестисравнительныйанализуровняфрагментацииДНКсперматозоидов у пациентов с различными нарушениями параметровспермограммы.3. Проанализировать взаимосвязь между степенью фрагментации ДНКсперматозоидов и преобладанием различных форм аномалий их головок.4. Проанализировать долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК упациентов с нарушениями конституционального кариотипа.5. СопоставитьуровеньфрагментацииДНКсуровнемгидроксиметилирования генома сперматозоидов у пациентов снарушением фертильности.6.

Оценить влияние нарушения целостности ДНК сперматозоидов наэффективность оплодотворения и развитие эмбрионов, полученных спомощью вспомогательных репродуктивных технологий.Научная новизна. Впервые установлено, что для носителей числовых иструктурных нарушений кариотипа характерно варьирование как уровняфрагментации ДНК сперматозоидов, так и параметров спермиологическогоанализа. Уверенно доказано, что увеличение доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженнымсодержанием морфологически нормальных сперматозоидов. Кроме того,выявлен морфологический маркер нарушения целостности ДНК5сперматозоидов – вакуолизированная головка. Впервые показано, чтовысокий уровень фрагментации ДНК соответствует высокому уровнюсодержания гидроксиметилированных сперматозоидов в эякуляте.

Доказано,что нарушение целостности ДНК сперматозоидов не снижает эффективностиоплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов прикультивировании in vitro.Теоретическаяипрактическаязначимость.Настоящееисследование выполнено в рамках изучения взаимоотношения генотип фенотип при формировании сложных признаков. Результаты настоящегоисследования вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи междуморфологическими характеристиками сперматозоидов и структурнофункциональными и эпигенетическими особенностями их генома.Понимание этой взаимосвязи позволит осуществлять направленнуюселекцию сперматозоидов, используемых для оплодотворения с цельюповышения его эффективности и вероятности развития нормальныхэмбрионов.Результатыпроведенногоисследованиямогутбытьиспользованы для разработки алгоритмаобследования пациентов снарушением фертильности, что особенно актуально для пар, прошедших ряднеудачных попыток ЭКО.Положения, выносимые на защиту:1.

Частота аномалий кариотипа у пациентов с нарушением фертильности,нуждающихся в применении вспомогательных репродуктивныхтехнологий, составляет 10,78%.2. Нарушение фертильности у мужчин в 70% случаев обусловленоснижением показателей спермиологического анализа, проведенного всоответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% случаев – всоответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.3.

Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характернодля пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальныхсперматозоидов в эякуляте.4. Вакуолизированнаяформаголовкисперматозоидаявляетсяморфологическим маркером нарушения целостности его ДНК.5. Для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа характеренширокий диапазон варьирования как параметров спермиологическогоанализа, так и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте.6. Для пациентов, в эякуляте которых повышено содержаниесперматозоидов с фрагментированной ДНК, характерен высокий уровеньсодержания 5-гидроксиметилированных сперматозоидов.Апробация работы.

Результаты работы опубликованы в виде пяти статей(три из них - в отечественных изданиях, рекомендованных ВАК, две – вмеждународныхнаучныхрецензируемыхжурналах).Материалыдиссертации были представлены на различных международныхконференциях и семинарах, в том числе 5-ом конгрессе по репродуктивноймедицине WARM (Москва, Россия, 2010 г.), 8-ой конференции поцитогенетике человека ECA (Порто, Португалия, 2011 г.), 10-ой конференции6средиземноморского общества репродуктивной медицины MSRM (Будва,Черногория, 2012 г.), 3-ей конференции молодых ученых и специалистов«Репродуктивная медицина: взгляд молодых» (Санкт-Петербург, Россия,2012 г.), 46-ой конференции по генетике человека ESHG (Нюрнберг,Германия, 2012 г.), 22-ой конференции репродуктивной ассоциациирепродукции человека (Геленджик, Россия, 2012 г.), первый национальныйфорум «Репродуктивное здоровье как фактор демографическойстабилизации» (Ростов-на-Дону, Россия, 2012 г.), 47-ой конференции погенетике человека ESHG (Париж, Франция, 2013 г.), первом российскоазиатском уро-андрологическом конгрессе (Санкт-Петербург, Франция, 2014г.), 17-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодыхисследователей (Санкт-Петербург, Россия, 2014 г.), 48-ой конференции погенетике человека ESHG (Милан, Италия, 2014 г.).Объем и структура диссертации.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации