Диссертация (1145911)
Текст из файла
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ ИРЕПРОДУКТОЛОГИИ ИМ. Д. О. ОТТА»На правах рукописиШильникова Евгения МихайловнаГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМАСПЕРМАТОЗОИДА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАНЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕЧЕЛОВЕКАСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:член-корр. РАН, з.д.н., д.м.н., профессор В.С.
БарановСанкт-Петербург2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................ 4ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... 81.1.
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ СПЕРМАТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА ...................................................................... 81.2. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В СПЕРМАТОЗОИДАХ ...... 131.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ ...................................................... 181.4. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИЧИНЫ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ ................................................................. 221.4.1. Нарушения кариотипа .....................................................................................................
221.4.2. Микроделеции Y хромосомы.......................................................................................... 271.4.3. Микроделеции генов аутосомной локализации и генов хромосомы X ...................... 291.4.4. Нарушение расхождения хромосом в мейозе ...............................................................
311.5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА СПЕРМАТОЗОИДА ......................... 331.5.1. Нарушение компактизации хроматина созревающего сперматозоида ...................... 341.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК ................................. 351.5.3. Апоптоз в процессе сперматогенеза .............................................................................. 371.5.4. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, качествоэмбрионов и наступление беременности в программах ВРТ .................................................. 38ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ..............................................................................................
422.1. МАТЕРИАЛ ................................................................................................................................... 422.2. МЕТОДЫ....................................................................................................................................... 422.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферическойкрови .............................................................................................................................................. 422.2.2.
QFH – окрашивание препаратов метафазных хромосом................................................ 432.2.3. Флуоресцентная гибридизаця in situ ................................................................................ 432.2.4. Спермиологический анализ ............................................................................................... 442.2.5. Методика приготовления препаратов из эякулята .......................................................... 452.2.6. Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-EndLabelling) .......................................................................................................................................
452.2.7. Предобработка препаратов из эякулята для иммунуцитохимической детекции 5метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с помощью антител .......................................... 462.2.8. Иммунуцитохимическая детекция 5MeС и 5hMeC с помощью антител напрепаратах из эякулята ................................................................................................................ 472.2.9.
Анализ препаратов ............................................................................................................. 472.2.10. Статистический анализ .................................................................................................... 48 3 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................................................................ 493.1. АНАЛИЗ КАРИОТИПА ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ .......................................... 493.2.
СПЕРМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ У ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ...................... 573.2.1. Повторный спермиологический анализ у пациентов с нарушением фертильности ... 583.2.2. Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа .......................... 603.3. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ И ЧАСТОТЫ ПОЯВЛЕНИЯЭМБРИОНОВ С ХРОМОСОМНЫМ ДИСБАЛАНСОМ У ПАЦИЕНТОВ С АНОМАЛИЯМИ КАРИОТИПА.........
623.4. АНАЛИЗ МОРФОЛОГИИ ГОЛОВОК ЭЯКУЛИРОВАННЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПАЦИЕНТОВ СНАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ........................................................................................................... 643.5. АНАЛИЗ ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ НАРУШЕНИИ ФЕРТИЛЬНОСТИ .............. 693.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки .................. 733.5.2. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения икачество эмбрионов, культивируемых in vitro ..........................................................................
753.6. ИММУНОДЕТЕКЦИЯ 5-MEC И 5-HMEC В СПЕРМАТОЗОИДАХ ИЗ ЭЯКУЛЯТА ПАЦИЕНТОВ СНАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ........................................................................................................... 773.7. СОПОСТАВЛЕНИЕ УРОВНЯ ФРАГМЕНТАЦИИ С УРОВНЕМ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ДНКСПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭЯКУЛЯТЕ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ ................................ 794. ОБСУЖДЕНИЕ .............................................................................................................................. 81ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 91ВЫВОДЫ .............................................................................................................................................
93СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .............................................................................................................. 94СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................................ 95ПРИЛОЖЕНИЕ А ............................................................................................................................ 112 4 ВВЕДЕНИЕ Нарушение сперматогенеза - одна из основных причин бесплодия, частота которогово многих странах, в том числе и в России, достигает 15% (WHO, 2010).
При этом вкладмужского фактора в его этиологию составляет 50-60% (WHO, 2010).В последние десятилетия отмечается значительное ухудшение качества эякулята(Slama et al., 2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013). Согласноданным Международного андрологического конгресса в большинстве случаев нарушениефертильности у мужчин сопровождается снижением показателей спермиологическогоанализа (Dohle et al., 2010; Jungwirth et al., 2013). Так, согласно проведенным исследованиям,среднее значение концентрации сперматозоидов в эякуляте за последние десятилетияснизилось практически в 1,5 раза (Carlsen et al., 1992; Cooper et al., 2010).
В последнемруководстве Всемирной Организации Здравоохранения по исследованию и обработкеэякулятачеловекареференсныезначенияосновныхпоказателейспермограммы:концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, существенно снижены (WHO,2010).К нарушению такого сложного и многоэтапного процесса, как сперматогенез,приводят как наследственные, так и экзогенные факторы. Среди наследственных фактороввыделяют нарушения кариотипа, в том числе числовые и структурные аномалии.Хромосомные перестройки затрудняют расхождение хромосом в мейозе, что приводит кснижению спермопродукции, и как следствие, нарушению фертильности. В то же время уносителейструктурныханомалийкариотипаповышеначастотаобразованиянесбалансированных гамет, которые могут принять участие в оплодотворении, увеличиваявероятность появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом.
Поэтому своевременныйанализ кариотипа позволит скорректировать стратегию преодоления бесплодия. Другойпричиной снижения фертильности у мужчин являются микроделеции Y хромосомы в локусеAZF. Известно так же, что сперматогенез контролируется более 2 000 генов, мутации вкоторых могут приводить к нарушениям процесса на том или ином этапе. Таким образом,генетические факторы обуславливают до 10-15%, а по некоторым данным до 50%, случаевнарушения сперматогенеза (Ferlin et al., 2007; Ferlin, 2012).Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играют факторы внешней среды,такие как курение, ожирение, стресс. Неблагоприятные факторы внешней среды приводят кобразованию активных форм кислорода (АФК) в клетке, и, как следствие, могут бытьпричиной окислительного стресса.
Последний, в свою очередь, напрямую связан с 5 процессомактивногоэпигенетическихдеметилированиямеханизмовДНК,регуляцииявляющегосяфункциигенов.однимВизосновныхпроцессеактивногодеметилирования происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин. При этом в ходепоследовательных биохимических реакций образуются кислородсодержащие производные5-метилцитозина,втомчисле5-гидроксиметилциозин.Дляизучениягидроксиметилирования ДНК разработан ряд подходов, одним из которых являетсяиммуноцитохимическаядетекция5-гидроксиметилцитозинаспомощьювысокоспецифичных моноклональных антител. Использование иммуноцитохимическогоподхода для оценки эпигенетического статуса генома особенно целесообразно при работе сотдельными клетками, в том числе половыми.Другой мишенью АФК является ДНК половых клеток.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
