Диссертация (1145911), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Метилирование осуществляетсяспециальными белками – ДНК метилтрансферазами (DNMT): DNMT1, DNMT2, DNMT3A,DNMT3B, DNMT3L. В геноме человека метилировано 60 – 90% CpG динуклеотидов (Ng andBird, 1999). Однако уровень метилирования неодинаков для разных стадий развитияорганизма, тканей и участков ДНК. Так, например, показано, что ДНК, выделенная из клетоксперматогенного ряда, содержит в 8 раз больше гипометилированных районов науникальных последовательностях генома по сравнению с ДНК соматических клеток (Oakeset al., 2007; Zamudio et al., 2008).Другим эпигенетическим механизмом регуляции генной активности являютсямодификации гистоновых белков, прежде всего гистонового комплекса, образующегонуклеосому.Последовательностьаминокислотныхостатковвгистоновыхбелкаххарактеризуется высокой консервативностью, однако сами аминокислотные остатки могутподвергаться различным пост-трансляционным модификациям, к числу которых относятацетилирование,метилирование,фосфорилирование,убиквитинилирование,сумоилирование и рибозилирование (Bradbury, 1992).
В зависимости от типа и сайтамодификаций аминокислотных остатков каждая нуклеосома имеет свой так называемый«гистоновый код», регулирующий активность транскрипции и определяющий доступностьДНК для транскрипционных факторов. Как правило, метилирование аминокислотныхостатков является маркером неактивного хроматина (например, метилирование гистона Н3по 9 остатку лизина (H3K9), в отличие от ацетилирования, служащего меткой активногохроматина (Rice and Allis, 2001). Так, например, гиперацетилирование коровых гистоновнаблюдается при замене гистонов на протамины в гаплоидных сперматидах (Sonnack et al.,2002).Эпигенетические модификации в мужских половых клетках играют важную роль вряде таких процессов как инактивация мобильных элементов генома, импринтинг генов,прохождение мейоза, инактивацей второй хромосомы Х, формирование полового пузырька,спермиогенез, оплодотворение и последующее эмбриональное развитие (Zamudio et al.,2008).На транспозонные элементы - ДНК транспозоны, ретротранспозоны, LINE и SINE –приходится до 45% генома человека.
Перемещение мобильных элементов генома можетбыть причиной нарушения рекомбинации, возникновения разрывов и перестроек хромосом,активации или репрессии генов сайта транспозиции (Deininger et al., 2003). 15 В процессе сперматогенеза сайленсинг транспозонных элементов происходит настадии гоноцитов. Метилирование мобильных элементов осуществляет метилаза DNMT3L.Так, при отсутствии данного фермента у самцов мыши не происходит метилированиятранспозонов LINE-1 и IAP. Отсутствие DNMT3L приводит к блокированию сперматогенезаи, как следствие, к бесплодию у самцов (Hata et al., 2006).Одно из ключевых событий гаметогенеза – эпигенетическое репрограммированиегенома. На стадии миграции ППК в зачатки гонад происходит активное деметилированиегенома, при этом деметилированными оказываются и импринтированные локусы.Деметилированноесостояниесперматогониях.Насперматогоний,происходитгеноманачальныхэтапахсохраняетсядосперматогенеза,метилированиенекоторыхвозобновлениянастадиигеновдлямитозавгоноцитов–установлениямоноаллельного характера их экспрессии.
Идентифицированы гены, импринтированные поотцовскому типу: H19-Igf2, Rasgrf and Dlk1-Gtl2. Метилирование ДНК данных геновосуществляется ферментами DNMT3А, DNMT3В и DNMT3L (Kato et al., 2007). Нарушениеметилирования импринтированных генов приводит к снижению фертильности. Так,показано,чтоупациентовсолигозооспермиейнарушаетсяметилирование7импринтированных локусов (Kobayashi et al., 2007).Эпигенетические механизмы ответственны за вступление клетки в мейоз. Так,метилирование H3K4 необходимо для дифференцировки стволовой сперматогенной(сперматогнии А) клетки в сперматоцит 1-го порядка (Glaser et al., 2009).Успешное прохождение мейоза сперматоцитами I порядка также регулируетсяэпигенетическими механизмами.
Фермент DNM3L создает особый характер метилированияхромосом, необходимый для прохождения мейоза. Так, при отсутствии данного ферментанарушается конденсация и спаривание гомологичных хромосом, происходит активациямобильных элементов, дерепрессия генов, наблюдается блокирование мейоза на стадиизиготены – пахитены и клеточная гибель (Bourc’his and Bestor, 2004; Webster et al., 2005).Активными участниками эпигенетической регуляции процесса мейоза являютсягистоновые метилазы SUV39H1, SUV39H2 и G9A (Zamudio et al., 2008). Гистоновыеметилтрансферазы отвечают за триметилирование лизина в положении 9 гистона Н3 вприцентромерных районах хромосом, обеспечивая гетерохроматинизацию данных областей.При отсутствии SUV39H1 и SUV39H2 наблюдается блокирование сперматогенеза на стадиипахитены (Peters et al., 2001). При отсутствии метилтрансферазы G9A происходит остановкаразвития на ранних этапах эмбриогенеза (Tachibana et al., 2007).С помощью эпигенетических механизмов происходит инактивация половых хромосомв мейозе.
В формировании полового пузырька участвуют белок ATR (ataxia telangiectasia and 16 Rad3 related), осуществляющий фосфорилирование варианта гистонового белка γH2A.X, ибелок BRCA1 (tumour suppressor protein breast cancer 1), обеспечивающий связывание ATR сH2A.X (Fernandez-Capetillo et al., 2003; Turner et al., 2004). Имеются данные, что инактивацияполовых хромосом продолжается и после мейоза. Показано, что 92% генов Х хромосомынаходятся в репрессированном состоянии на стадии пахитены и 87% генов после завершениямейоза (Namekawa et al., 2006).На заключительном этапе сперматогенеза – спермиогенезе – происходит не толькоформирование сперматозоида, но и глобальная реорганизация ДНК.
Компактизация ДНКосуществляется путем замены гистонов на более основные белки - протамины. Заменагистоновых белков на протамины представляет собой многоэтапный процесс, начинающийсяс замещения гистонов на специфичные для сперматогенеза гистоновые варианты, например,гистоновый вариант tH2В или вариант гистонового белка Н1 – Н1Т2, присутствующий состадии округлых до стадии продолговатых сперматид (Tanaka and Baba, 2005). Потеряданного белка приводит к формированию морфологически аномальных, малоподвижныхсперматозоидов с низким уровнем содержания протаминов (Tanaka and Baba, 2005). Важнуюроль в процессе замены гистоновых белков на протамины играет ацетилирование гистонов,приводящее к дестабилизации их связи с ДНК. Гистоновые белки сначала замещаются наменее основные, чем протамины, транзиторные белки TP1 и TP2, которые играют важнуюроль в компактизации хроматина сперматид.
На модельных объектах показано, чтонокаутирование по одному из генов транзиторных белков приводит к снижениюфертильности (Shirley et al., 2004). Впоследствии транзиторныебелки замещаются напротамины. У человека выделяют два типа протаминов – PRM1 и PRM2.
Показано, чтоотсутствие одной из форм протаминов или нарушение соотношения между двумя формамиприводит к нарушению сперматогенеза (Cho et al., 2004; Aoki et al., 2006). Важную рольиграют и эпигенетические модификации самих протаминов, например, фосфорилированиеPRM2 киназой CAMK4 (calmodulin-dependent protein kinase IV) (Aoki and Carrell, 2003). Приотсутствии данного фермента наблюдается заметное снижение числа продолговатыхсперматид и отсутствие сперматозоидов (Wu et al., 2000).
ДНК сперматозоида в комплексе спротаминами образует компактные тороидальные структуры. Образование дисульфидныхсвязей между протаминами способствует дополнительной стабилизации хроматинасперматозоида. Безусловно, протаминирование ДНК сперматозоида необходимо длякомпактизации и защиты ДНК. Кроме того, его можно рассматривать как один измеханизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов (Carrell et al., 2008). Нарушениезамены гистонов на протамины приводит к снижению фертильности и сказывается нараннем эмбриональном развитии (Carrell, 2012). 17 Не все гистоновые белки замещаются на протамины.
В геноме сперматозоидасодержится около 5-10% остаточных гистонов (Hammoud et al., 2012). Согласно одной измоделей организации хроматина сперматозоида участки ДНК, связанные с протаминами,формируют тороидальные единицы, соединенные с остаточными гистонами ДНК (Ward,2010). Связанная с остаточными гистонами ДНК чувствительна к действию повреждающихагентов. Действительно, показано, что при увеличении уровня остаточных гистоновповышается степень повреждения ДНК сперматозоидов (Garcia-Peiro et al., 2011).Остаточные гистоны расположены в геноме сперматозоида не случайно. Показано,что преимущественно они локализованы в промотерных областях генов раннегоэмбрионального развития, импринтированных генов и генов микроРНК (Jones et al., 2011).Некоторые гистоновые варианты, например tH2B или H2Az, локализованы в промотерахгенов ионных каналов и генов, контролирующих сперматогенез, а также в районахприцентромерного гетерохроматина.
Остаточные гистоны в промотерах различных геновмодифицированы по-разному. Так, метка активного хроматина H3K4me3 или неактивногохроматина H3K27me3 характерна для генов сперматогенеза, а метка H3K4me2 характернадля генов эмбрионального развития (Carrell and Hammoud, 2010). Интересно отметить, чтомногие гены раннего эмбрионального развития одновременно имеют одновременно меткуактивного H3K4me3 и неактивного хроматина H3K27me3, что создает так называемоебивалентное состояние, при котором гены подготовлены для будущей активации, однакоостаются неактивными до тех пор, пока не будет удалена репрессивная метка (Hammoud etal., 2010).В последнее время активно изучается метилом мужской половой клетки. Показано,что характер метилирования ДНК сперматозоида отличается от такового в соматическихклетках, однако сходен с метилированием ДНК в эмбриональных стволовых клетках (Carrelland Hammoud, 2010).
Нарушение метилирования ДНК сперматозоида приводит к снижениюфертильности (Kumar et al., 2013). Изменение общего уровня метилирования ДНКсперматозоида приводит к нарушению оплодотворения и раннего эмбрионального развития(Benchaib et al., 2005).В последнее время особое внимание привлекает 5-гидроксиметилцитозин промежуточное соединение, возникающее в процессе деметилирования ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
