Диссертация (1145911), страница 15
Текст из файла (страница 15)
71 Таблица 9. Фрагментация ДНК сперматозоидов в контрольной группе доноров спермы и уразличных групп пациентов по нормативам ВОЗ 1999 и 2010 годовДоля сперматозоидов сГруппа пациентов по результатам спермограммыфрагментированной ДНК (%)Доноры спермы0,19±0,03Нормозооспермия по нормативам ВОЗ 1999 г.0,39±0,12Нормозооспермия по нормативам ВОЗ 2010 г.0,75±0,09Тератозооспермия по нормативам ВОЗ 1999 г.0,79±0,08Тератозооспермия по нормативам ВОЗ 2010 г.0,81±0,1Интересно отметить, что наименьшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК(0,39±0,12%) выявлена у пациентов с нормозооспермией по норам ВОЗ 1999 года.
ДолисперматозоидовсфрагментированнойДНКупациентовснормозооспермиейитератозооспермией по данным ВОЗ 2010 года не отличались (p>0,05) (U-критерий МаннаУитни).С помощью дисперсионного анализа (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) былопоказано достоверно значимое отличие средних значений в исследуемых группах (p≤0,005).Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нормозооспермией понормам ВОЗ 2010 года достоверно отличалась от таковой в контрольной группе и упациентов с нормозооспермией по нормам 1999 года, однако не отличалась от таковой упациентов с тератозооспермией по нормам ВОЗ 1999 года.
В то же время долясперматозоидов с фрагментированной ДНК среди пациентов с тератозооспермией по нормамВОЗ 2010 года достоверно отличалась от таковой в контрольной группе и принормозооспермии по нормам ВОЗ 1999 года, но не отличалась от таковой у пациентов стератозооспермией по нормам ВОЗ 1999 года.У пациентов с аномалиями кариотипа доля сперматозоидов с фрагментированной ДНКсоставила 0,66±0,21 и была достоверно выше соответствующих показателей в контроле(p≤0,05).Следует отметить, что доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК значительноварьировала в зависимости от типа аномалии кариотипа (таблица 10). 72 Таблица 10. Фрагментация ДНК сперматозоидов пациентов с аномалиями кариотипаДоля сперматозоидов с фрагментированнойКариотипДНК (%)47,XYY0,246,XY/47,XXY0,3846,XY,add(22)(p11)0,0546,XY,inv(7)(p22;q11.2)2,2746,XY,der(13;14)(q10;q10)1,0746,XY,der(13;14)(q10;q10)0,6846,XY,der(14;21)(q10;q10)0,3446,XY,t(1;5)(p22;q32),t(6;12)(q15;q21)0,4546,XY,t(1;7)(q42;p22)0,0946,XY,t(6;19)(p22;q12)0,45Наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК наблюдалась приналичии инверсии хромосомы 7, а также робертсоновских транслокаций междухромосомами 13 и 14 (таблица 10).Наименьшие доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК наблюдались упациентов с реципрокной транслокацией между хромосомами 1 и 7, а также у пациента сдополнительным материалом на хромосоме 22.Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с робертсоновскимитранслокациями между хромосомами 13 и 14 достоверно не отличались (р=0,4763).
При этомдолясперматозоидовсфрагментированнойДНКупациентасробертсоновскойтранслокацией между хромосомами 14 и 21 была достоверно ниже, чем у пациентов сробертсоновскими транслокациями между хромосомами 13 и 14 (р=0,0483).Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с робертсоновскимитранслокациями в кариотипе и реципрокными транслокациями достоверно не отличались(р=0,2532).Упациентовсчисловымианомалиямикариотипадолясперматозоидовсфрагментированной ДНК в среднем составила 0,29±0,09 и достоверно не отличалась от долив контрольной группе (р=0,4913). 73 3.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки Проведена оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов,сгруппированных по преобладанию той или иной формы головки сперматозоидов (таблица11).Поданнымстатистическогоанализапоказателидолисперматозоидовсфрагментированной ДНК в исследуемых группах имели нормальное распределение(критерий Колмогорова-Смирнова).
С помощью дисперсионного анализа (ANOVA) былопоказано достоверно значимое отличие средних значений в исследуемых группах (p≤0,05).Установлено, что при преобладании вакуолизированной формы головки сперматозоидов,доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК достоверно выше, чем при преобладанииаморфных, грушевидных или головок с патологией акросомы. Таблица 11. Фрагментация ДНК сперматозоидов при преобладании определенной аномалииголовок сперматозоидовФорма головкиДоля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (%)Аморфная0,62±0,07Грушевидная0,65±0,13Вакуолизированная1,02±0,17С патологией акросомы0,46±0,12Между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей сперматозоидов свакуолизированной формой головки была установлена взаимосвязь (r = 0,33 (p≤0,05))(рисунок 12). Между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долейсперматозоидов с грушевидной, аморфной и сперматозоидов с патологией акросомыкорреляции выявлено не было (р>0,05).
74 Рисунок12.Эмпирическиеданныеилиниярегрессиидолисперматозоидовсвакуолизированной формой головки по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНКС помощью микроманипуляционного оборудования у 4 пациентов с нормальныммужским кариотипом и тератозооспермией были отобраны 89 сперматозоидов с нормальнойформой головки и 196 - с вакуолизированной (таблица 12).Таблица 12. Фрагментация ДНК сперматозоидов с вакуолизированной и нормальной формойголовкиЧислоЧисло головок сДоля сперматозоидовпроанализированныхфрагментированнойс фрагментированнойголовок (n)ДНК (n)ДНК (%)Нормальная8911,12*Вакуолизированная1962814,29*Форма головки* достоверно значимые отличия p=0,0008 (точный тест Фишера) 75 Флуоресцентный сигнал, свидетельствующий о фрагментации ДНК, в сперматозоидахс нормальной головкой обнаружен лишь в одном случае из 89 (1,12%) и визуализирован в 28из 196 (14,29%) вакуолизированных головках.
Таким образом, фрагментация ДНКсперматозоидов с вакуолизированной формой головки была достоверно выше (p=0,0008).3.5.2. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворенияи качество эмбрионов, культивируемых in vitro Для оценки влияния фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение икачествоэмбрионовбылопроанализировано54эмбриологическихпротоколаэкстракорпорального оплодотворения (приложение А таблица 9).
В 20 протоколахоплодотворениеооцитовпроводилиметодомЭКО,в34–методомвнутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (метод ICSI). Выбор методаоплодотворения зависел от показателей спермиологического анализа.Основными критериями включения являлись известные нормальные кариотипысупругов, оплодотворение методом ЭКО или ICSI в день получения ооцит - кумулюсныхкомплексов, перенос эмбрионов в полость матки на 4 и/или 5 день развития.Эффективность оплодотворения оценивали с учетом метода оплодотворения и долисперматозоидов с фрагментированной ДНК. В каждой из двух групп, отличающихсяспособом оплодотворения, были выделены две подгруппы: с долей сперматозоидов сфрагментацией менее 0,35% и более 0,35% (пороговое значение доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК у доноров спермы), достоверно отличающиеся друг от друга(p≤0,0001, критерий Краскела-Уоллиса) (таблица 13).Эффективность оплодотворения рассчитывали как отношение числа двупронуклеарныхзигот к числу полученных ооцит-кумулюсных комплексов, выраженное в %.
Показателькачества эмбрионов рассчитывали как отношение числа эмбрионов на стадии морулы на 4сутки развития (Grade 4, Tao et al., 2002) к числу двупронуклеарных зигот, выраженное в %. 76 Таблица 13. Эффективность оплодотворения и доля эмбрионов высшего качества,культивируемых in vitro, с учетом доли сперматозоидов с фрагментированной ДНКМетодЧислоДоля сперматозоидов соплодотворенияпротоколовфрагментированной ДНК(n)(%)110,07±0,0264,15±7,5991,24±0,2954,51±13,23170,1±0,0365,23±5,67171,08±0,1562,71±6,22ЭКОICSIПрисравненииэффективностиоплодотворенияЭффективностьоплодотворения (%)взависимостиотдолисперматозоидов с фрагментированной ДНК, как при оплодотворении методом ЭКО., так ипри оплодотворении методом ICSI, достоверных отличий обнаружено не было (р=0,3977,ANOVA).Показатель качества эмбрионов рассчитывали как отношение числа эмбрионов настадии морулы на 4 сутки развития (Grade 4, Tao et al., 2002) к числу двупронуклеарныхзигот, выраженное в % (приложение А таблица 9).
Между показателями долисперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей эмбрионов высшего качества былавыявлена взаимосвязь ( коэффициент корреляции Спирмена r = - 0,51, p=0,0001) (рисунок13). 77 Рисунок 13. Эмпирические данные и линия регрессии доли эмбрионов высшего качества подоле сперматозоидов с фрагментированной ДНК3.6. Иммунодетекция 5-MeC и 5-hMeC в сперматозоидах из эякулята пациентов снарушением фертильности С помощью антител к 5-гидроксиметилцитозину и 5-метилцитозину проведеноиммунофлуоресцентноеокрашиваниесперматозоидов21пациентаснарушениемфертильности.
Включение 5-hMeC и 5-MeC оценивали по наличию или отсутствиюфлуоресцентных сигналов. Для каждого пациента проанализировано не менее 5000сперматозоидов (приложение А таблица 10).Наличие метки 5-МеС было установлено во всех сперматозоидах, тогда какфлуоресценция 5-hМеС зарегистрирована только в единичных клетках (рисунок 14). 78 Рисунок 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
