Диссертация (1145911), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Сперматозоиды из эякулята после окрашивания (А) DAPI, (Б) с помощьюантител к 5-MeC и (В) к 5-hMeC.Доля сперматозоидов, содержащих 5-hMec, в контрольной группе доноров спермыварьировала от 0,06% до 4,03, составляя в среднем 1,24±0,94%.Доли сперматозоидов, содержащих 5-hMec, в группе пациентов с нормальныммужским кариотипом варьировала от 0,3% до 13,89%, составляя в среднем 3,89±0,76%.При сравнение доли сперматозоидов, содержащих сигнал 5-hMeC, у пациентовразных групп по результатам спермиологического анализа достоверных отличий обнаруженоне было (p=0,3472, критерий Краскела-Уоллиса).Таблица 14.
Содержание сперматозоидов с 5-гидроксиметилцитозином в эякуляте пациентовс нарушением фертильностиРезультатспермограммыЧисло пациентов (n)Доля сперматозоидов,содержащих 5-hMeC (%)А13,16АТ112,83ОА10,32Н35,26±3,24Т153,85±0,94Доля сперматозоидов, содержащих 5-hMec, в группе пациентов с хромосомнымианомалиями кариотипа варьировала от 1,7% до 8,2%, составляя в среднем 6±1,46% (таблица15). 79 Таблица 15. Содержание сперматозоидов с 5-гидроксиметилцитозином в эякулятепациентов с аномалиями кариотипаДоля сперматозоидов,содержащих 5-hMeC (%)Кариотип46,XY,add(22)(p11)46,XY,t(1;5)(p22;q32),t(6;12)(q15;q21)46,XY,t(6;19)(p22;q12)47,XYY1,77,38,26,8При совмещении фотоизображений после окрашивания с помощью антител к 5-MeC и5-hMeC было выявляется определенная комплементарность иммунофлуоресцентныхсигналов: сперматозоиды с низкойинтенсивностью 5-MeC, имели более выраженныйсигнал 5-hМеС (рисунок 15).Рисунок 15.
Иммунофлуоресцентное окрашивание эякулированных сперматозоидов спомощью антител к (А) 5-MeC и (Б) 5- hMeC.3.7. Сопоставление уровня фрагментации с уровнем гидроксилирования ДНКсперматозоидов в эякуляте пациентов с нарушением фертильности Для оценки взаимосвязи между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК идолей сперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин был проведен регрессионныйанализ, по результатам которого между данными параметрами была выявлена взаимосвязь(коэффициент корреляции Спирмена r=0,52, p=0,0152) (рисунок 16) (приложение А таблица10). 80 Рисунок 16.
Эмпирические данные и линия регрессии доли сперматозоидов, содержащих 5hMeC по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК 81 3. ОБСУЖДЕНИЕСперматогенез человека – сложный многоэтапный процесс, в результате которогопутем последовательных делений и преобразований из диплоидных клеток формируютсявысокоспециализированные гаплоидные половые клетки – сперматозоиды, основнойфункцией которых является хранение и транспортировка наследственной информации. Кизменению морфо-функциональных свойств сперматозоидов и структурно-функциональногосостояния их генома могут приводить возникающие на любом из этапов сперматогенезанарушения, вызванные как наследственными, так и экзогенными факторами.Среди наследственных факторов выделяют аномалии кариотипа, мутации геновхромосомы Y и аутосом.
Аномалии кариотипа выявляют в 2 – 19% случаев нарушенияфертильности, при этом числовые аномалии встречаются чаще, чем структурные (Shi andMartin, 2001; Ferlin et al., 2006, Martin, 2008; Huleyuk et al., 2010). В результате анализакариотипа 204 пациентов, обратившихся в отделение вспомогательных репродуктивныхтехнологий в связи с бесплодием, у 22 из них выявлены числовые и структурные аномалии.При этом, в нашем исследовании, напротив, структурные аномалии встречались чаще, чемчисловые, что, скорее всего, было связано с особенностями выборки: носители структурныханомалий кариотипа, в отличие от носителей числовых, не имеют выраженныхфенотипических проявлений и обычно направляются на кариотипирование только привозникновении репродуктивных проблем.Выявленные в нашем исследовании числовые аномалии были представлены дисомиейпо хромосоме Y (47,XYY) (n=1), мозаичным вариантом синдрома Кляйнфельтера(47,ХХY/46,XY) (n=1), сверхчисленной маркерной хромосомой (47,XY,+mar) (n=2), в томчисле в мозаичном варианте (47,XY,+mar/46,XY) (n=2), мозаичным носительствомперестроенной хромосомы Y (45,X/46,X,der(Y)) (n=1).Дисомия по хромосоме Y и регулярная или мозаичная дисомия хромосомы X вкариотипе у мужчин – наиболее часто встречающиеся числовые аномалии половыххромосом (Nguyen et al., 2014).
Как правило, носители дополнительной хромосомы Yфертильны,хотя,спермиологическогодлятакиханализа:отпациентовхарактернонормозооспермиидоварьированиепоказателейолигоастенотератозооспермии(Milazzo et al., 2006; Abdel-Razic et al., 2012). В настоящем исследовании для пациента скариотипом 47,XYY отмечено снижение доли морфологически нормальных сперматозоидов,при этом остальные показатели спермиологического анализа были в норме. Считается, что утаких пациентов 47,XYY сперматогонии вступают в мейоз с образованием анеуплоидных 82 гамет, при этом большинство анеуплоидных клеток элиминируется апоптозом как в ходемейоза, так и после него. Следовательно, в результате массовой гибели клеток происходитснижение концентрации сперматозоидов в эякуляте.
В то же время некоторые клетки могутизбегать программируемой клеточной гибели в результате абортивного апоптоза. В такомслучае для эякулированных сперматозоидов характерны признаки апоптоза, в том числе,фрагментация ДНК (Milazzo et al., 2006).
Исходя из этого, мы проанализировали уровеньфрагментации ДНК сперматозоидов для данного пациента и показали, что он не превышаеттаковой в контрольной группе доноров спермы. Вероятно, в данном случае дополнительнаяхромосома Y теряется во время мейоза.Варьирование показателей спермиологического анализа характерно и для пациентов смозаичным вариантом синдрома Кляйнфельтера (Staessen et al., 2003).
В нашей работе упациента с таким кариотипом отмечалась нормальная концентрация при сниженииподвижностиидолиморфологическинормальныхсперматозоидов.Мытакжепроанализировали уровень фрагментации ДНК сперматозоидов и показали, что он непревышает таковой в контрольной группе доноров спермы. Полученные результаты можнообъяснить либо элиминацией дополнительной хромосомы X в мейозе, либо гонадныммозаицизмом.
В последнем случае равновероятно как наличие только 46,XY сперматогонийв герминативном эпителии, так и преимущественное вступление 46,XY сперматогоний вмейоз.Полное отсутствие сперматозоидов в эякуляте наблюдалось у пациента с кариотипом45,X/46,X,der(Y). При такой хромосомной патологии в большинстве случаев наблюдаетсяазооспермия, реже – олигозооспермия (Efthymiadou et al., 2012).Среди пациентов с нарушением фертильности доля носителей маркерной хромосомысоставляет 0,165%, среди новорожденных – 0,043% (Liehr et al., 2004; Liehr and Weise, 2007).При этом, доля носителей маркерной хромосомы среди мужчин выше, чем среди женщиноднако, в большинстве случаев, маркерная хромосома имеет материнское происхождение(Buckston et al., 1985).
Следовательно, в ходе сперматогенеза вероятны как потеря маркернойхромосомы в мейозе, так и блокирование мейоза из-за присутствия маркерной хромосомы вкариотипе. Полученные в ходе нашего исследования данные скорее свидетельствуют впользу последнего, поскольку во всех случаях при наличии сверхчисленной маркернойхромосомы в кариотипе наблюдалось снижение показателей спермиологического анализа.Вероятно, сверхчисленные маркерные хромосомы в кариотипе связаны с нарушениемфертильности, однако до сих пор малоизучен механизм этой взаимосвязи. 83 Робертсоновские транслокации выявляют у 0,7%, реципрокные транслокации – у0,5%, а инверсии - у 0,16% пациентов с нарушением фертильности (De Braekeleer et al.,2006).В нашем исследовании среди пациентов со структурными аномалиями наиболее частовстречались носители робертсоновских и реципрокных транслокаций: их доля составила2,45% от общего числа пациентов и 22,73% от числа пациентов с аномалиями кариотипа.
Поданным литературы эти показатели составляют 1,6% и 20-30%, соответственно (Ogur et al.,2006).Наиболее часто центрические слияния происходят между хромосомами группы D: 13и 14 (Huynh et al., 2002). Из 5 выявленных в нашем исследовании случаев робертсоновскихтранслокаций4произошли45,ХY,der(13;14)(q10;q10)),одинмежду–указаннымимеждухромосомамихромосомами14и(кариотипы21(кариотип45,ХY,der(14;21)(q10;q10)).У всех носителей робертсоновских транслокаций в кариотипе наблюдалось снижениепоказателей спермиологического анализа: в двух случаях – ОАТ, в двух случаях – Т, в одном–ОТ.Интересноотметить,чтоуодногоизпациентовскариотипом45,ХY,der(13;14)(q10;q10) результат спермограммы по прошествии нескольких месяцевизменился с ОАТ на Т. Значительное варьирование показателей спермиологического анализаотмечено и для других носителей структурных перестроек. Вероятно, что на результатспермиологического анализа влияют не только тип перестройки, гены, локализованные вместах разрыва, но и некоторые внешние факторы.
Так, в руководстве ВОЗ перечисленыэкзогенные факторы, такие как вирусная и бактериальная инфекции, оказывающие сильноенегативное влияние на сперматогенез (WHO, 2010).Анализ уровня фрагментации ДНК сперматозоидов носителей робертсоновскихтранслокаций показал, что у двух пациентов с кариотипами 45,ХY,der(13;14)(q10;q10) долисперматозоидов с фрагментированной ДНК не отличалась между собой и были вышетаковой у доноров спермы.
У пациента с кариотипом 45,ХY,der(14;21)(q10;q10) долясперматозоидов с фрагментированной ДНК была достоверно ниже таковой у пациентов скариотипами 45,ХY,der(13;14)(q10;q10) и не отличалась от соответствующего показателя вконтрольной группе доноров спермы. Таким образом, наши результаты дополняютсуществующие сведения об уровне фрагментации ДНК сперматозоидов пациентов сробертсоновскими транслокациями (Perrin et al., 2013).Также варьирование показателей спермиологического анализа было отмечено дляпациентов с реципрокными транслокациями, при этом отмечались динамические измененияпоказателей спермограмм. Анализ уровня фрагментации ДНК сперматозоидов показал, что 84 доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в двух случаях незначительно превышала, ав одном была ниже таковой у доноров спермы.Среди мужчин с нарушением фертильности инверсии встречаются в 13 раз чаще, чемсреди новорожденных мальчиков (Krausz and Forti, 2000).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
