Диссертация (1145911), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Затемпрепараты отмывали в трех сменах фосфатного буфера (1хPBS, pH 7,6), содержащего 0,5%Tween20, по 3 минуты в каждой смене, на водяной бане при температуре +43С.На влажные препараты под покровные стекла наносили по 100 мкл блокирующегораствора, содержащего антитела, конъюгированные флуорохромом Alexa 488 и Alexa 555 вразведении 2:500, и инкубировали в течение 75 минут во влажной камере при +37С.Отмывали в трех сменах фосфатного буфера 1хPBS (рН 7,6), содержащем 0,5% Tween20, по3 минуты в каждой смене на водяной бане при температуре +43С Далее отмывали препаратыв двух сменах фосфатного буфера 1хPBS (рН 7,6) при комнатной температуре в течение 3минут в каждой, споласкивали в воде и высушивали при комнатной температуре, после чегопроводили по серии спиртов возрастающей концентрации (70, 80, 96%).Препараты заключали в фотозащитный раствор Vectaschield H-1200, содержащийDAPI.
Связывание антител регистрировали по распределению флуоресцентных сигналов.2.2.9. Анализ препаратов Анализ препаратов проводили с помощью микроскопов:•ЕС ЛЮМАМ-РПО11 (ЛОМО) с объективами СХ 20х/0,45 и М-флюар100х/1,30 с тубусной оптикой с линзами от 1,1х до 1,6х, черно-белой CCD камеройнакопления сигнала (Chiper), 48 •Zeiss Axiostar Plus, оборудованного объективами Zeiss A-plan10х,0,25 и100х/1,25 oil;•LEICA DMI 3000B, оборудованного объективами 5х, 10х, 20х/0,4, 40х/0,60 иL63x, микроманипулятором Narishige IM-6;•LEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR 20x/0,40 и 100x/1,30-0,060, автоматической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC Twain. Дляполучения фотоизображения использовали программное обеспечение Leica DFCTwain.Для анализа видеоизображения использовали программное обеспечение AdobePhotoshop CS5.Идентификацию QFH-окрашенных метафазных хромосом проводили руководствуясьстандартами международной цитогенетической номенклатурой хромосом человека (ISCN,2009).2.2.10.
Статистический анализ Статистический анализ данных проводили на ПК с помощью программ Stat Graphics иGraph Pad Software. 49 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности Всего кариотипировано 204 пациента из бесплодных супружеских пар. Исследованиевыполнено на препаратах метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови. Длякаждого пациента проанализировано не менее 15 метафазных пластинок.Порезультатам кариотипированиясформированы две группы: пациенты снормальным мужским кариотипом (n=182, 89,22%) (группа 1) и пациенты с аномалиямикариотипа (n=22, 10,78%) (группа 2). Полученные результаты приведены в таблицах 1, 2 и 3и в приложении А (таблица 1).В группу 1 вошли пациенты с нормальным мужским кариотипом 46,XY (n=159,77,94%), а также пациенты, в кариотипе которых были выявлены полиморфные вариантыхромосом (n=23, 11,28%).Последние были представлены увеличенными гетерохроматиновыми блоками:длинного плеча Y хромосомы (кариотип 46,XYqh+) (n=5), длинного плеча хромосомы 1(кариотип 46,XY,1qh+) (n=8), длинного плеча хромосомы 3 (кариотип 46,XY,3qh+) (n=2),длинного плеча хромосомы 16 (кариотип 46,XY,16qh+) (n=2); наличием спутников накоротких плечах хромосом 13 (кариотип 46,XY,13ps+) (n=1), 15 (кариотип 46,XY,15ps+)(n=2), 22 (кариотип 46,XY,22ps+) (n=2), и спутничных нитей на коротких плечах хромосомы15 (кариотип 46,XY,15pstk+) (n=1) (таблица 1).
50 Таблица 1. Кариотипы пациентов группы 1Кариотип46,XYнормальный мужскойнормальный46,XYqh+мужской,n%15977,9452,4583,9320,9820,9810,4920,9820,9810,49увеличенныйгетерохроматиновый блок длинного плеча Yхромосомынормальный46,XY,1qh+мужской,гетерохроматиновыйблокувеличенныйдлинногоплечахромосомы 1нормальный46,XY,3qh+мужской,гетерохроматиновыйблокувеличенныйдлинногоплечахромосомы 3нормальный46,XY,16qh+мужской,гетерохроматиновыйблокувеличенныйдлинногоплечахромосомы 1646,XY,13ps+46,XY,15ps+46,XY,22ps+46,XY,15pstk+нормальный мужской, увеличенные спутники накоротком плече хромосомы 13нормальный мужской, увеличенные спутники накоротком плече хромосомы 15нормальный мужской, увеличенные спутники накоротком плече хромосомы 22нормальный мужской, увеличенные спутничныенити на коротком плече хромосомы 15В группу 2 вошли пациенты, в кариотипе которых обнаружены числовые (n=7, 3,43%)и структурные аномалии хромосом (n=15, 7,35%) (таблица 2 и таблица 3).
51 Таблица 2. Кариотипы пациентов группы 2. Структурные и числовые аномалии аутосомКариотипn%10,4910,4910,4941,9610,4910,4910,49cбалансированныймужской,46,XY,inv(4)(p12;q21),inv(10)(p11;q21)перицентрическиеинверсии хромосом4 и 10cбалансированныймужской,46,XY,inv(1)(pter→p32::q21→p32::q21→qter) перицентрическаяинверсияхромосомы 1cбалансированныймужской,46,XY,inv(7)(p22;q11.2)перицентрическаяинверсияхромосомы 7cбалансированныймужской,45,XY,der(13;14)(q10;q10)центрическоеслияниехромосом13 и 14cбалансированныймужской,45,XY,der(14;21)(q10;q10)центрическоеслияниехромосом14 и 21cбалансированныймужской,46,XY,t(2;3)(q33;q29)реципрокнаятранслокациямеждухромосомами 2 и 346,XY,t(1;5)(p22;q32),t(6;12)(q15;q21) cбалансированный 52 мужской,реципрокнаятранслокациямеждухромосомами 1 и 5,реципрокнаятранслокациямеждухромосомами 6 и 12cбалансированныймужской,46,XY,t(1;14)(p36.1;q32.1)реципрокнаятранслокация10,4910,4910,4910,4920,98междухромосомами 1 и 14cбалансированныймужской,46,XY,t(6;19)(p22;q12)реципрокнаятранслокациямеждухромосомами 6 и 19cбалансированныймужской,46,XY,t(1;7)(q42;p22)реципрокнаятранслокациямеждухромосомами 1 и 7мужской,дополнительный46,XY,add(22)(p11)генетическийматериалнахромосоме 22мужской,47,XY,+marсверхчисленнаямаркерная 53 хромосомамужской,мозаицизм47,XY,+mar/46,XYпосверхчисленной20,98маркернойхромосомеТаблица 3.
Кариотипы пациентов группы 2. Структурные и числовые аномалии половыххромосомКариотипn%10,4910,4910,4910,49мужской,нереципрокная46,XX,der(X),t(X;Y)(p22.3;p11.3)транслокациямеждуполовымихромосомами47,XYYмужской, дисомияпо Y хромосомемужской,47,ХХY/46,XYмозаичныйвариант синдромаКляйнфельтерамужской,45,X/46,X,der(Y)мозаицизмперестроеннойпохромосоме YЧисловые аномалии выявлены в системе аутосом (n=4, 1,96%) и половых хромосом(n=3, 1,47%).Числовые аномалии аутосом были представлены: сверхчисленной маркернойхромосомой (47,XY,+mar) (n=2) (рисунок 1 А) и мозаичным носительством маркернойхромосомы (47,XY,+mar/46,XY) (n=2).Числовые аномалии в системе половых хромосом были представлены: дисомией по Yхромосоме (47,XYY) (n=1), мозаичным вариантом синдрома Кляйнфельтера (47,ХХY/46,XY)(n=1), мозаичным носительством перестроенной Y хромосомы (45,X/46,X,der(Y)) (n=1).
54 Структурные аномалии аутосом были представлены перицентрическими инверсиями(n=3),робертсоновскимитранслокациями(n=5)(рисунок1Б),реципрокнымитранслокациями (n=5), а также дополнительным генетическим материалом на хромосоме(n=1).А)Б)Рисунок 1. Метафазные пластинки после QFH/AcD окрашивания хромосом излимфоцитов периферической крови пациентов с кариотипами А) 47,XY,+marи Б)45,XY,der(13;14)(q10;q10) (ув.
10х100)У обследованных пациентов выявлены перицентрические инверсии хромосомы 1(кариотип 46,XY,inv(1)(pter→p32::q21→p32::q21→qter)) (n=1), хромосомы 7 (кариотип46,XY,inv(7)(p22;q11.2))(n=1),атакжехромосом4и10(кариотип46,XY,inv(4)(p12;q21),inv(10)(p11;q21)) (n=1) (рисунок 3).В четырех случаях робертсоновских транслокаций центрическое слияние произошломежду хромосомами 13 и 14 (45,XY,der(13;14)(q10;q10) (рисунок 1 Б), в одном – междухромосомами 14 и 21 (45,XY,der(14;21)(q10;q10)).Реципрокные транслокации зарегистрированы между хромосомами 2 и 3 (кариотип46,XY,t(2;3)(q33;q29))(n=1)(рисунок2),1и5,и6и12(кариотип46,XY,t(1;5)(p22;q32),t(6;12)(q15;q21)) (n=1), 1 и 14 (кариотип 46,XY,t(1;14)(p36.1;q32.1))(n=1), 6 и 19 (кариотип 46,XY,t(6;19)(p22;q12)) (n=1), хромосомами 1 и 7 (кариотип46,XY,t(1;7)(q42;p22)) (n=1).В одном случае был выявлен дополнительный генетический материал на хромосоме22 (кариотип 46,XY,add(22)(p11))., в одном - нереципрокная транслокация между половымихромосомами 46,XX,der(X),t(X;Y)(p22.3;p11.3) (n=1, 0,49%).
55 В отдельных случаях, для уточнения результатов кариотипирования и локализацииточек разрыва был проведен ряд дополнительных исследований с использованиемфлуоресцентной гибридизации in situ.Локализацияточекразрыванахромосомахпациентаскариотипом46,XY,t(2;3)(q33;q29) проводилась с помощью диагностики FISH с цельнохромосомнымзондом для хромосомы 2, и центромерным зондом для хромосомы 3 (рисунок 2).А)Б)Рисунок 2. Метафазные хромосомы из лимфоцитов периферической крови пациента скариотипом 46,XY,t(2;3)(q33;q29) после А) QFH/AcD окрашивания и Б) флуоресцентнойгибридизации in situ с цельнохромосомным зондом для хромосомы 2 (флуоресцирует взеленом спектре) и центромерным зондом для хромосомы 3 (в красном) (ув.
10х100)У пациента с наличием двух перицентрических инверсий в кариотипе была проведенауточняющая FISH диагностика с цельнохромосомным зондом к хромосоме 4, центромернымзондом к хромосоме 10 и с зондом, специфичным к дистальному району хромосомы 10(рисунок3),порезультатам46,XY,inv(4)(p12;q21),inv(10)(p11;q21). которойбылподтвержденкариотип 56 А)Б)В)Г)Рисунок 3. Метафазные хромосомы из лимфоцитов периферической крови пациента скариотипом 46,XY,inv(4)(p12;q21),inv(10)(p11;q21) после А) QFH/AcD окрашивания Б)флуоресцентной гибридизации in situ с центромерным зондом к хромосоме 10(флуоресцирует в зеленом спектре) В) с цельнохромосомным зондом к хромосоме 4(флуоресцирует в зеленом спектре) и Г) с зондом, специфичным к дистальному районухромосомы 10 (флуоресцирует в оранжевом спектре) 57 3.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
