Диссертация (1145766), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Однако, в этом случае сверхэкспрессия SFP1 не приводилак возникновению приона, вероятно, вследствие наличия в этом штамме аллелидикого типа гена SUP45.При этом, как показано ранее, суммарное количество белка Sfp1,распределенного между растворимой и осадочной фракциями в штамме [ISP+],в клетках которого SFP1 экспрессируется под контролем собственногопромотора, не изменено по сравнению со штаммом [isp-] (Rogoza et al., 2010).В связи с этим у нас возник вопрос, как влияет повышенная экспрессиягена SFP1 на эффективность нонсенс-супрессии в штаммах, не содержащихприон [ISP+].
Для оценки последствий сверхэкспрессии SFP1 мы взяли дваштамма, несущих различные нонсенс-супрессорные мутации в генах SUP35или SUP45.Анализ эффективности нонсенс-супрессии, обусловленной мутациямиsup35, на фоне повышенной экспрессии гена SFP1 показал, что во всехкомбинациях супрессорных и супрессируемых мутаций наблюдается снижениесупрессорного эффекта (см. рисунок 15), однако в подавляющем большинствеклонов эффективность супрессии восстанавливалась после элиминациимультикопийной плазмиды. Следовательно, все перечисленные выше эффектыявляются собственными эффектами сверхэкспрессии SFP1, не связанными собразованием прионного детерминанта. Таким образом, повышенная продукциямутантного белка Sfp1 обладает таким же фенотипическим эффектом, как и егоприонизация.
К обсуждению этого факта мы вернемся ниже.Вместе с тем, некоторые клоны, несущие мутацию sup35-10, сохранялинесупрессорныйфенотипипослеэлиминацииплазмиды,однаковосстановление супрессии происходило после пассирования таких клонов на100среде с GuHCl. Это говорит о том, что повышенная экспрессия SFP1 привела кпоявлению в некоторых клетках детерминанта, схожего по своим проявлениям,в том числе по влиянию на размер клеток, с [ISP+]. Важно отметить, что у этихклонов не обнаружено значащих замен в нуклеотидной последовательностигена SUP45.
Из этого следует, что возникновение и поддержание [ISP+]возможно не только в штаммах, несущих специфические криптические мутацииsup45, как это было показано ранее (Volkov et al., 2002; Аксенова и др., 2006),но и на фоне аллели SUP45 дикого типа. Вероятно, частота такого событиязначительно ниже частоты возникновения [ISP+] в штаммах, несущихспецифические комбинации мутаций в генах SUP35 и SUP45, однако этотвопрос требует специального изучения.Как уже упоминалось, в штамме [ISP+] имеет место усиление экспрессиимутантной аллели гена SUP35. Мы показали также, что к усилению экспрессиигена SUP35 приводит сверхэкспрессия SFP1 в штамме [isp-].
Что касаетсяделеции гена SFP1, то, если получить ее в штамме [ISP+], наблюдаетсянеобратимая элиминация этого приона, что послужило одним из первыхдоказательств того, что [ISP+] является продуктом прионного превращениябелка Sfp1 (Rogoza et al., 2010). В настоящей работе показано, что делецияSFP1 в штамме [isp-] приводит к появлению нонсенс-супрессии, что позволяетпредположить, что у таких штаммов снижена эффективность терминациитрансляции. Действительно, этот фенотипический эффект сопровождаетсяснижением экспрессии генов SUP35 и SUP45 и уменьшением количествакодируемых этими генами белков.Таким образом, изучение последствий сверхэкспрессии и делеции генаSFP1 позволяет сделать вывод, что SFP1 является позитивным регуляторомэкспрессии гена SUP35.
Вместе с тем, механизмы этой регуляции не вполнепонятны.101Интересно отметить, что в промоторе гена SUP35 есть два потенциальныхсайтасвязыванияSfp1p,однакосогласнобазеoPOSSUM3.0(http://opossum.cisreg.ca/oPOSSUM3/) (Kwon et al., 2012), их сходство сканоническим сайтом связывания Sfp1p составляет менее 85%. Таким образом,регуляторный эффект SFP1 по отношению к SUP35, по всей видимости,опосредован какими-то дополнительными белками – транскрипционнымифакторами, функция которых зависит от уровня экспрессии SFP1.Что касается функциональной связи между генами SFP1 и SUP45, то онатоже, несомненно, существует, однако механизм этой связи, по-видимому, ещеболее сложен, чем в случае гена SUP35. Об этом говорят следующие факты:сверхэкспрессия SFP1 в штаммах, несущих нонсенс-мутации в гене SUP45,приводит к снижению эффективности супрессии; в случае миссенс-мутацийэтот эффект менее однозначен.
Анализ количества белка Sup45 в штаммах,несущих аллель дикого типа SUP45 и одну из использованных в работемиссенс-мутаций, показал, что сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количествоSup45. В штамме с нонсенс-мутацией сверхэкспрессия SFP1 приводит кувеличениюколичествафрагментабелкаSup45,образующегосяпритерминации трансляции на стоп-кодоне, возникшем вследствие мутации.Количество полноразмерного Sup45p в этом штамме такое же, как в контроле(см. рисунок 25).
Увеличение количества фрагмента Sup45p, синтезируемогопод контролем мутантной аллели, говорит о повышении эффективноститерминациитрансляцииприсверхэкспрессииSFP1.Обэтомжесвидетельствует снижение эффективности супрессии, зарегистрированное уэтого мутанта. Оно обусловлено тем, что образующийся в результатепреждевременной терминации фрагмент белка Sup45 не может обеспечитьнормальную терминацию, поскольку у него отсутствуют 155 С-концевыхаминокислотных остатков и, соответственно, сайт связывания со вторым102фактором терминации – Sup35p (eRF3) (Eurwilaichitr et al., 1999). Посколькуколичество полноразмерного белка Sup45 в этом штамме не увеличивается, мыпредположили, а затем и показали, что наблюдаемые эффекты обусловленыповышением уровня Sup35p в этих штаммах (см.
рисунок 26).В то же время в случае штаммов, несущих миссенс-мутантные аллелиSUP45, повышенная продукция белка Sup35p не приводит к снижениюэффективности супрессии, то есть к увеличению эффективности терминациитрансляции. Можно предположить, что мутантный белок Sup45 в этом случаехарактеризуется сниженным сродством к стоп-кодону, поэтому увеличениеколичества Sup35p не приводит к повышению эффективности терминации.Интересно, что данные транскриптомного анализа (Jorgensen et al., 2002),касающиеся изменения количества мРНК SUP45 при сверхэкспрессии SFP1,неоднозначны, а именно показывают снижение, увеличение и последующееснижение уровня мРНК этогогена в зависимости отдлительностиэксперимента.
В наших экспериментах значимых различий в уровне Sup45pдикого типа при нормальном и увеличенном уровне экспрессии SFP1 необнаружено. Таким образом, можно предположить, что Sfp1p не осуществляетнепосредственную регуляцию экспрессии SUP45 или же вклад такой регуляцииневысок.Наши эксперименты по оценке влияния делеции SFP1 на количествомРНК, транскрибируемой с генов SUP35 и SUP45, и белков, соответствующихэтим генам, показали, что делеция SFP1 существенно снижает уровеньэкспрессии обоих генов.
Таким образом, по сумме полученных данных можноутверждать, что SFP1 является позитивным регулятором экспрессии геновSUP35 и SUP45, хотя механизм регуляции носит опосредованный характер,особенно по отношению к гену SUP45.В качестве иллюстрации, подводящей итоги исследования зависимости103экспрессии генов SUP35 и SUP45 от уровня экспрессии гена SFP1 иприонизации белка Sfp1, можно предложить схему, представленную на рисунке31.sfp1ΔSUP35SFP1SUP45[ISP+]Рисунок 31. Уровень экспрессии генов SUP35 и SUP45 зависит от статуса белкаSfp1.
Зелеными соединительными линиями показано негативное влияние наэкспрессию, а красными линиями — позитивное. Черная линия показывает, чтодостоверного влияния на уровень экспрессии SUP45 зарегистрировано не было.Стоит отметить, что во всех использованных в работе штаммахсверхэкспрессия SFP1 приводит к видимому снижению скорости роста. Sfp1р,как транскрипционный фактор влияет на многие функции дрожжевой клетки. Влитературе описаны эксперименты по анализу эффектов сверхэкспрессии SFP1на скорость роста и морфологию клеток.
Так, авторы отмечают, чтосверхэкспрессия SFP приводит к снижению скорости роста (Sopko et al., 2006;Yoshikawa et al., 2011) и к увеличению количества клеток с большими почками(Xu and Norris, 1998), что может свидетельствовать о том, что Sfp1pрепрессирует переход клетки из стадии G2 в стадию митоза. При попыткеобъединения перечисленных выше данных возникает вопрос: чем может бытьобусловлено снижение скорости роста штаммов, сверхэкспрессирующих SFP1,104по сравнению с контролем? Снижение скорости роста может быть вызвано кактоксичностью белка для клетки в случае сверхпродукции, так и изменениями впрохождении стадий клеточного цикла, характерными для таких штаммов;наблюдаемый эффект может быть обусловлен и обоими факторами. Пока ниимеющиеся в литературе данные, ни результаты наших исследований не могутоднозначно свидетельствовать в пользу какой-то из этих гипотез.Как можно объяснить усиление экспрессии гена SUP35 вследствиеприонизации белка Sfp1? Сложно представить, что в прионной форме Sfp1pработает эффективнее, как транскрипционный фактор, непосредственносвязывающийся с промотором SUP35, тем более, что в промоторе гена SUP35сайты связывания SFP1 не найдены.
Вероятно, влияние прионизации Sfp1p наэкспрессию гена SUP35 опосредовано каким-то другим белком. Можнопредположить несколько гипотез:1) В агрегаты, формируемые Sfp1р, может включаться белок, негативнорегулирующий экспрессию SUP35;2) Прионная форма Sfp1р может связывать белки, влияющие на экспрессиюдругих генов, продукты которых вовлечены в регуляцию экспрессии SUP35;3)ПрионизацияSfp1риндуцируетприонноепревращениебелка,регулирующего экспрессию SUP35.Для ответа на вопрос о механизмах, обеспечивающих усилениеэкспрессии гена SUP35 вследствие прионизации Sfp1p, в дальнейшемнеобходимо искать гены, уровень экспрессии которых существенно изменен вштамме [ISP+] по сравнению со штаммом [isp-] и штаммом с делецией SFP1, исреди них пытаться выявить гены, продукты которых функционально связаны странскрипцией SUP35.105ВЫВОДЫ1.В штамме, содержащем прионную форму белка Sfp1, детерминант [ISP+],повышен уровень экспрессии гена SUP35 и снижен уровень экспрессии генаSUP45, что проявляется как на уровне мРНК этих генов, так и на уровнесоответствующих белков.2.Увеличение количества мутантного белка Sup35, синтезируемого подконтролем аллели SUP35, несущей миссенс-мутацию, может приводить кснижениюэффективностинонсенс-супрессии,чтосвидетельствуетокомпенсации нарушения терминации трансляции.3.Снижение эффективности нонсенс-супрессии в присутствии прионногодетерминанта [ISP+] обусловлено увеличением количества фактора терминациитрансляции Sup35р (eRF3).4.ЭкспрессияэффективностьгенаSFP1снонсенс-супрессии,мультикопийнойобусловленнойплазмидымутациямиснижаетsup35.Вотношении мутаций sup45 это влияние носит аллеспецифичный характер.5.Снижение эффективности нонсенс-супрессии при повышении экспрессиигена SFP1 сопровождается увеличением количества белка Sup35 присохранении количества белка Sup45.6.Делеция гена SFP1 приводит к нонсенс-супрессии и сопровождаетсязначительным снижением уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45 и,соответственно, уменьшением количества белков Sup35 и Sup45.7.Полученные данные позволяют утверждать, что ген SFP1 вовлечен вконтроль терминации трансляции путем регуляции синтеза фактора терминацииSup35 (eRF3).106СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Аксенова А.Ю., Волков К.В., Ровинский Н.С., Свитин А.В., МироноваЛ.Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
