Диссертация (1145766), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Вместе с тем логичнопредположить, что усиление эффективности терминации трансляции можетбыть связано с увеличением количества белков, обеспечивающих этот процесс.В связи с этим, на первом этапе работы мы сравнили характер экспрессии геновSUP35 и SUP45, кодирующих факторы терминации трансляции eRF3 и eRF1соответственно, в штаммах [ISP+], [isp-] и sfp1Δ.3.1.1. Количество мРНК генов SUP35 и SUP45 в штаммах [ISP+], [isp-] иsfp1ΔЧтобы установить, связан ли антисупрессорный эффект [ISP+] сизменением в транскрипции генов SUP35 и SUP45, мы сравнили уровеньтранскрипции этих генов в [ISP+] и [isp-] вариантах штамма 25-25-2В-П3982, а67также в производном этого штамма, несущем делецию гена SFP1 (вдальнейшем они обозначаются как [ISP+], [isp-] и sfp1Δ-штаммы) с помощьюПЦР в режиме реального времени.
Для амплификации фрагментов генов SUP35и SUP45 использованы пары праймеров SUP35-F и SUP35-R, и SUP45-F иSUP45-R, соответственно; для амплификации референсного гена ADH1использованы праймеры F-ADH1-RT и R-ADH1-RT (см. Материалы и методы).Мы обнаружили, что эффективность транскрипции гена SUP35 в штамме[ISP+] примерно в 4 раза выше, чем в штамме [isp-] (рисунок 8).Рисунок 8. Количество мРНК гена SUP35 увеличено в штамме [ISP+] иуменьшено в штамме sfp1Δ по сравнению со штаммом [isp-].
Здесь и далее наоси ординат (ΔCq) отложена разница между значениями критического цикладля исследуемого гена и референсного (ADH1) в логарифмическом масштабе, акаждаяточкаобозначаетоднубиологическуюповторность.Цифрамипредставлено соотношение медиан выборок. ** — различия статистическизначимы (p < 0,01, критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).68Вместе с тем, уровень экспрессии гена SUP45 в штамме [ISP+] несколькоснижен (рисунок 9).
Наименьший уровень экспрессии обоих генов наблюдали вштамме sfp1Δ.Рисунок 9. В штамме [ISP+] и в штамме sfp1Δ количество мРНК гена SUP45снижено по сравнению со штаммом [isp-]. ** — различия статистическизначимы (p < 0,01, критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).3.1.2. Количество белков Sup35 и Sup45 в штаммах [ISP+], [isp-] и sfp1ΔТаким образом, транскрипция по крайней мере одного из двух генов,кодирующих дрожжевые факторы терминации трансляции, гена SUP35, вштамме[ISP+]использованнымиусиленавпоэтомсравнениюэксперименте.сдвумяЭтотдругимифактштаммами,явилсяпервымподтверждением гипотезы, проверяемой в этой части работы.Вместе с тем известно, что изменения в уровне транскрипции генов невсегда прямо коррелируют с изменениями в количестве соответствующихбелков.
Поэтому на следующем этапе работы мы оценили количество белков69Sup35 и Sup45 в этих же штаммах с помощью вестерн-блот анализа.Количественную обработку результатов вестерн-блоттинга осуществляли спомощью программы ImageJ (см. раздел «Материалы и методы»).Мы показали, что количество белка Sup35 в штамме [ISP+] выше, чем вштамме [isp-] (рисунок 10). Различия в количестве белка Sup35 междуштаммами [ISP+] и [isp-] согласуются с различиями в уровне мРНК (см. рисунок8), а наименьшее количество белка Sup35 выявлено в штамме с делецией SFP1.Рисунок 10. Количество белка Sup35 увеличено в штамме [ISP+] и уменьшено вштамме sfp1Δ по сравнению со штаммом [isp-]. Использованы первичныеантитела SE90, опознающие Sup35p.
Тотальный белок окрашивали сиспользованием раствора Кумасси R-250. Цифрами представлено отношениеинтегральной оптической плотности полос на пленке, характеризующейштаммы [ISP+] и sfp1Δ, к контролю, штамму [isp-].Что касается количества белка Sup45, то оно также коррелировало сколичеством мРНК в исследуемых штаммах: в штамме [ISP+] этого белка было70немного меньше, чем в штамме [isp-], а наименьшее количество Sup45pобнаружено в штамме с делецией SFP1 (рисунок 11).Рисунок 11. В штамме [ISP+] и в штамме sfp1Δ количество Sup45 снижено посравнению со штаммом [isp-]. Использованы первичные антитела SE45-2,опознающие Sup45p. Тотальный белок окрашивали с использованием раствораКумасси R-250. Цифрами представлено отношение интегральной оптическойплотности полос на пленке, характеризующей штаммы [ISP+] и sfp1Δ, кконтролю, штамму [isp-].Таким образом, в штамме [ISP+] увеличено количество одного изфакторов терминации трансляции — белка Sup35 (eRF3).
Исходя из этого,можно предположить, что изменение фенотипа штамма с супрессорного (Sup+)на несупрессорный (Sup-), наблюдаемое при возникновении [ISP+], связано сувеличением количества этого фактора терминации.713.2. Сверхэкспрессия мутантной аллели гена SUP35 приводит кантисупрессииПонятно, что увеличение количества фактора терминации трансляцииможет повысить эффективность терминации. Вместе с тем, необходимоподчеркнуть, что функция белка Sup35 в использованных штаммах частичнонарушена, поскольку он синтезируется под контролем мутантной аллели sup3525, приводящей к омнипотентной нонсенс-супрессии. Эта аллель приводит кзамене треонина на изолейцин в 378-м положении.
Ранее было показано, чтоэффективность считывания стоп-кодонов всех трех типов в присутствии этоймутации снижена (Volkov et al., 2002). Как согласовать эти данные с нашимиданными, приведенными в предыдущем разделе работы? Иными словами,может ли увеличение количества мутантного белка Sup35 компенсироватьдефект нарушения терминации трансляции? Такие данные в литературеотсутствуют.Чтобы проверить такую возможность, мы трансформировали штамм 2525-2В-П3982 [isp-] мультикопийной плазмидой pRSU3-25, несущей мутантнуюаллельsup35-25.Вкачествеконтролябылиспользованштамм,трансформированный мультикопийной плазмидой pRS425.
Трансформантовотбирали на среде, не содержащей лейцин. Поскольку антисупрессорныйэффект [ISP+] наиболее отчетливо проявляется по отношению к мутации lys287, последствия повышенной экспрессии мутантной аллели sup35-25 мыоценивали на среде, не содержащей лизин.Фенотипическийанализтрансформантовпоказал,чтоэкспрессиямутантной аллели sup35-25 с плазмиды pRSU3-25 приводит к изменениюфенотипа с Sup+ на Sup- (рисунок 12, А). Чтобы проверить, увеличивается липри этом количество белка Sup35 в клетках трансформантов плазмидой pRSU325, мы провели вестерн-блот гибридизацию с использованием поликлональныхантител SE90, опознающих Sup35p. В случае сверхэкспрессии мутантнойаллели sup35-25 количество соответствующего белка увеличено в 1672раз (рисунок 12, Б).Рисунок 12.
Экспрессия мутантной аллели sup35-25 с мультикопийнойплазмиды pRSU3-25 приводит к антисупрессии (А) и к значительномуувеличению количества белка Sup35 (Б). Плазмида pRS425 использована вкачестве контроля.Таким образом, увеличение количества белка Sup35, содержащего заменуThr378→Ile,действительнокомпенсируетснижениеэффективноститерминации, обусловленное мутацией sup35-25. Следовательно, антисупрессия,наблюдаемая при возникновении [ISP+], также может быть следствиемувеличения количества белка, синтезируемого под контролем аллели sup35-25.3.3.
Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35 иsup45В соответствии с критериями прионного наследования, сверхэкспрессиягена SFP1, являющегося структурным геном приона [ISP+], в штаммах [isp-]приводит к индукции этого приона. Однако ранее в работах нашей группыпоказано, что антисупрессорный эффект, связанный со сверхэкспрессией SFP1,не всегда связан с возникновением [ISP+], поскольку примерно у четвертитрансформантовэлиминацияплазмиды,несущейSFP1,приводитквосстановлению исходного супрессорного фенотипа. Возможно, в этом случае73происходит образование ненаследуемой формы [ISP+], подобно тому, как этоописано для [PSI+].
Показано, что сверхпродукция белка Sup35, образующегодетерминант [PSI+], может приводить к нонсенс-супрессии без образованиястабильного приона, благодаря формированию амилоидных агрегатов, которыехарактеризуются низкой способностью к передаче от клетки к клетке в ходемитотических делений (Salnikova et al., 2005). Низкая трансмиссибельностьотличает такие амилоидные агрегаты от прионизованной формы Sup35p.
Другоевозможное объяснение восстановления эффективности супрессии послеэлиминации плазмиды состоит в том, что сверхпродукция белка Sfp1 обладаетсамостоятельнымантисупрессорнымэффектом,несвязаннымсегоприонизацией. Увеличение эффективности терминации трансляции в результатеповышения продукции белка Sfp1 может рассматриваться как указание напрямое или косвенное участие этого белка в регуляции терминации. В связи сэтим возникла необходимость более детального исследования влиянияповышенной экспрессии гена SFP1 на проявление различных мутантныхаллелей SUP35 и SUP45.3.3.1. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35Штамм, на котором было показано, что сверхэкспрессия SFP1 приводит квозникновению приона [ISP+], содержит нонсенс-супрессорную мутацию sup3525 и криптическую мутацию sup45-400 (Rogoza et al., 2010).
Ранее прион [ISP+]был обнаружен также в штамме, несущем нонсенс-супрессорную мутациюsup35-10 и криптическую мутацию sup45-75 (Volkov et al., 2002; Аксенова и др.,2006). Для расширения представления о влиянии гена SFP1 на терминациютрансляции необходимо проанализировать эффекты сверхэкспрессии гена SFP1в штаммах, несущих другие комбинации аллелей SUP35 и SUP45.Для этого мы использовали штамм 21-Д863, содержащий дизрупциюхромосомной копии гена SUP35 и компенсирующую эффект дизрупции74центромерную плазмиду pYCHU2, несущую аллель SUP35 дикого типа. Важноеотличие этого штамма от использованных ранее заключается в том, что он несеталлель дикого типа гена SUP45, что было специально подтвержденосеквенированием.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
