Диссертация (1145766), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Bagriantsev and Liebman, 2004; см. Wickner et al., 2004). Однако,несмотря на то, что доказано, что структурным геном детерминанта [PIN+]является RNQ1, существуют другие прионы, которые могут функционироватькак [PIN+]-факторы, стимулируя образование прионов (см. Staniforth et al.,2012).На данный момент выявлен прионный домен RnqPD белка Rnq1,обогащенный аспарагином и глутамином (аминокислоты 132-405). Показано,что RnqPD полимеризуется более эффективно, чем полноразмерный белок Rnq1и способен к взаимодействию с Sup35NM (Vitrenko et al., 2007).461.6.3. Прионный детерминант [NSI+]Нехромосомный детерминант [NSI+] (от Nonsense Supression Inducer) былвыявлен как омнипотентный нонсенс-супрессор в штаммах, несущих делециюфрагмента хромосомной копии гена SUP35, кодирующего N-терминальныйдомен, или модифицированный ген SUP35, полученный из Pichia methanolica.(Saifitdinova et al., 2010).
Как и в случае с прионом [PSI+], детерминант [NSI+]проявляет нонсенс-супрессорный эффект по отношению к маркерныммутациям ade1-14 и trp1-289. При этом [NSI+] элиминируется при пассированиина среде, содержащей GuHCl, а также при делеции, но не сверхэкспрессииHSP104. [NSI+] проявляет неменделевский, 4:0, характер наследования примейозе, способен спонтанно возникать de novo и передается при цитодукции.При этом показано, что поддержание [NSI+] не зависит от структурных геновдругих известных прионов (Saifitdinova et al., 2010). При скринингемультикопийными плазмидами выявлено, что гены SUP35, SUP45 и VTS1модифицируют плейотропные фенотипические эффекты этого детерминанта(Nizhnikov et al., 2012).
Так, повышенная экспрессия генов SUP35 или SUP45маскирует супрессорный эффект детерминанта [NSI+]. Ген VTS1, вовлеченный врегуляцию NMD, наоборот, усиливает нонсенс-супрессию, влияя таким образомна эффективность терминации трансляции и вегетативный рост дрожжей.Структурный ген приона [NSI+] на настоящий момент не выявлен.1.6.4. Прионный детерминант [ISP+]В 2002 году в нашей лаборатории при скрининге мутантов по гену SUP35был идентифицирован новый эпигенетический детерминант дрожжей [ISP+] (отInversion of Suppressor Phenotype), и было показано его влияние на точностьтрансляции (Volkov et al., 2002).
Оно заключалось в антисупрессорном эффектепо отношению к некоторым омнипотентным нонсенс-супрессорным мутациям47sup35. Ряд свойств, такие как нехромосомный характер наследования,доминантное проявление, излечивание на среде, содержащей гидрохлоридгуанидина (GuHCl) и спонтанное возникновение с частотой 10-4 на клетку нагенерацию, а также способность к передаче при цитодукции позволилипредположить, что [ISP+] тоже является прионом. Изначально рассматривалосьпредположение, что этот детерминант является разновидностью детерминанта[PSI+] (Волков и др., 2000). Однако [ISP+] способен поддерживаться в клетках,несущих делецию прионного (N-) домена белка Sup35.
Кроме того, наподдержание [ISP+] не влияет шаперон Hsp104, обеспечивающий наследование[PSI+] (Volkov et al., 2002).В присутствии [ISP+] супрессия всех трех стоп-кодонов практическиотсутствует, а у штамма [isp-] эффективность супрессии увеличивается внесколько десятков раз. Из этого следует, что [ISP+] представляет собойвысокоэффективный детерминант, нейтрализующий последствия нарушениятерминации трансляции, обусловленные некоторыми мутациями sup35.Для исследования детерминанта [ISP+] и поиска структурного гена былпроведен скрининг инсерционной библиотеки генов. В результате этого поискавыявлены гены UPF1, UPF2 и SFP1 (Рогоза и др., 2009).
Гены UPF1 и UPF2 неявляются структурными генами детерминанта [ISP+], поскольку их делеция хотьи приводит к потере детерминанта [ISP+], но эта элиминация являетсяобратимой.Третий выявленный при скрининге ген кодирует белок Sfp1, обогащенныйаспарагином и глутамином.
Во всех скринингах, проведенных к настоящемувремени in silico, белок Sfp1 попадает в перечень потенциальных прионов(Michelitsch and Weissman, 2000; Harrison and Gerstein, 2003; Alberti et al., 2009).Рогоза с соавторами (Rogoza et al., 2010) показали, что инактивация гена SFP1приводит к необратимой потере детерминанта [ISP+] и проявлению стабильногосупрессорного фенотипа, обусловленного мутациями sup35, а сверхэкспрессияэтого гена в штаммах [isp-] приводит к изменению фенотипа с супрессорного нанесупрессорный с частотой, близкой к 100%. Гипотеза, согласно которой [ISP+]48является прионной формой Sfp1p, подтверждена с помощью цитологических ибиохимическихисследований,атакжеспомощьюфлуоресцентноймикроскопии.Белок Sfp1 является транскрипционным фактором и контролируетэкспрессию большого количества генов, продукты которых вовлечены вбиогенез рибосом, прохождение стадий клеточного цикла, контроль размераклеток, выживание клеток в различных стрессовых условиях (Xu and Norris,1998; Jorgensen et al., 2002; Fingerman et al., 2003; Jorgensen et al., 2004; Cipollinaet al., 2008а; 2008b).
Экспрессия SFP1 увеличивается при повреждении ДНК, амутациипогенуSFP1делаютштаммыболеечувствительнымикионизирующей радиации, чем штаммы, несущие SFP1 дикого типа (Xu andNorris, 1998). Показано также, что делеция SFP1 приводит к нарушениямклеточного цикла: клетки не способны переходить из фазы G2 в M.
Этопозволило предположить, что SFP1 работает как репрессор при переходе отфазы G2 в М (Xu and Norris, 1998). Делеция этого гена приводит к заметномуснижению скорости роста и размера клеток (Cipollina et al., 2008a). Важноотметить, что в число генов, контролируемых SFP1, входят гены SUP35 иSUP45 (Fingerman et al., 2003).Известно, что мутации в гене SFP1 приводят не только к дефектампроцесса транскрипции, но могут нарушать и процесс трансляции. Мутанты погену SFP1 проявляют чувствительность к таким антибиотикам, влияющим напроцесс трансляции, как паромомицин, циклогексимид и гигромицин, посравнению с клетками, содержащими ген SFP1 дикого типа (Fingerman et al.,2003).Интересно отметить, что в ходе исследования связи между детерминантом[ISP+] и геном SFP1 показано, что сверхэкспрессия SFP1 приводит не только киндукции [ISP+], но и к антисупрессорному фенотипу, который исчезает послепотери мультикопийной плазмиды (в случае индукции [ISP+] антисупрессорныйфенотип сохраняется после потери плазмиды).
Восстановление супрессорногофенотипа наблюдается примерно у четверти клонов (Rogoza et al., 2008).49Для объяснения этого явления можно предложить две гипотезы. Вопервых, нельзя исключить, что при сверхэкспрессии SFP1, наряду снаследуемыми прионными агрегатами белка Sfp1, образуется ненаследуемаяамилоиднаяформабелка,подобнотому,какэтопроисходитприсверхэкспрессии гена SUP35 (явление мультикопийной супрессии) (Salnikova etal., 2005; Kushnirov et al., 2007). Во-вторых, увеличение количества белка Sfp1 вклетке может влиять на считывание стоп-кодонов за счет какого-то другогомеханизма, не связанного с возникновением амилоидной формы Sfp1р.Важнейшей особенностью [ISP+] является то, что штаммы, несущие этотдетерминант, по многим признакам, таким как эффективность супрессии,скорость роста, чувствительность к антибиотикам, отличаются от штаммов, укоторых ген SFP1 делетирован (Rogoza et al., 2010).
Из этого следует, чтоприонизация приводит не к инактивации белка Sfp1, а к изменению его свойств.Поскольку Sfp1p — это транскрипционный фактор, возможно, что [ISP+] можетслужить модельюдля изучения эпигенетического контроля регуляцииэкспрессии генов.Очевидно, таким образом, что ген SFP1 является неизвестным ранеекомпонентом системы, контролирующей считывание стоп-кодонов у дрожжей.Особый интерес вызывает тот факт, что белок Sfp1 способен переходить вприонную конформацию. Это открывает перспективы для дальнейшеговыяснения роли прионных детерминантов в контроле клеточных функций.1.7.
ЗаключениеТаким образом, стоп-кодоны не всегда выполняют функцию кодоновтерминаторов, и определенный уровень считывания этих кодонов как значащихявляется свойством белоксинтезирующего аппарата (Инге-Вечтомов, 1969).Считывание стоп-кодонов происходит как на фоне мутационных событий,затрагивающих различные компоненты белоксинтезирующего аппарата и50взаимодействующие с ними белки, не участвующие непосредственно втрансляции, так и в отсутствие мутаций. В последнем случае считывание стопкодонов обеспечивается естественным уровнем ошибок в работе аппарататрансляции, а также, как показали исследования последних 20 лет, изменениемфункциональной активности некоторых белков за счет их прионногопревращения.Нарушения в работе аппарата трансляции могут приводить как кувеличению, так и к снижению эффективности считывания стоп-кодонов.Понятно, что важное значение для этих исследований имеет выявление новыхгенов, контролирующих считывание стоп-кодонов, и максимально подробнаяхарактеристика их функций.В связи с этим, целью данной работы является выяснение роли гена SFP1в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей SaccharomycescerevisiaeВ рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
