Диссертация (1145766), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Роль рРНК и рибосомных белков в нонсенс-супрессииРибосомы всех живых организмов состоят из двух субъединиц, сборкакоторыхтребуетточноскоординированныхпроцессовтранскрипции,модификации и процессинга предшественников рРНК и синтеза рибосомныхбелков.
В последние годы достигнуты большие успехи в исследовании этихпроцессов, а также в изучении структуры и функций рибосом. Одним изважных событий стало определение атомной структуры рибосом прокариот, зачто в 2009-м году была присуждена Нобелевская премия (Ban et al., 2000;Schluenzen et al., 2000; Wimberly et al., 2000). Исследование рибосом эукариот— более трудоемкий процесс, поскольку они больше по размеру и значительносложнее организованы, чем рибосомы прокариот. Тем не менее, в 2011-м годувыяснена кристаллическая структура рибосомы Saccharomyces cerevisiae приразрешении 3,0 Å (Ben-Shem et al., 2011). Большая, 60S, субъединица рибосомыдрожжей содержит три молекулы рРНК (25S, 5,8S, 5S) и 46 белков, в то времякак малая субъединица включает одну молекулу рРНК (18S) и 33 белка (см.19Melnikov et al., 2012).
32 белка из 79-ти не имеют гомологов среди рибосомбактерий или архей (Lecompte et al., 2002; Spahn et al., 2001).Участиерибосомныхбелковвконтролеточноститрансляциипервоначально было обнаружено при исследовании мутантов E. coli. Придобавлении стрептомицина, аминогликозидного антибиотика, воздействующегона рРНК, происходило восстановление прототрофности по аргинину у штаммаE. coli,содержащегононсенс-мутациювгене,кодирующеморнитинтранскарбамилазу (один из ферментов биосинтеза аргинина) (Rossetand Gorini, 1969).
Мутации, затрагивающие белки рибосом у E. coli, могутповышать или, наоборот, понижать уровень неоднозначности трансляции. Так, врибосоме был идентифицирован центр неоднозначности — «Ram» (отRibosomal ambiguity), образуемый белками S4 и S5 (Rosset and Gorini, 1969).Мутации в генах, кодирующих эти белки, приводят к уменьшению точноститрансляции и ослаблению устойчивости к аминогликозидным антибиотикам,что проявляется в виде супрессии (Deusser et al., 1970; Funatsu et al., 1972;Piepersberg et al., 1975; Cabezon et al., 1976; Ogle et al., 2003).
Считается, чтомутации в генах, кодирующих белки S4 и S5 приводят к стабилизации закрытойконформации A-сайта рибосомы, что приводит к повышению вероятностивключения несоответствующей кодону мРНК аминоацил-тРНК (Ogle et al.,2003). Изменения в белках S12 (Ozaki et al., 1969; Gorini, 1970), S17 (Bollen etal., 1975) и L6 (Kuhlberger et al., 1979) приводят к повышению точноститрансляции, что может проявляться в виде антисупрессии.Впоследствии аналогичные эксперименты по выявлению мутаций,влияющих на эффективность трансляции, были проведены с использованиемантибиотика паромомицина на дрожжах (Anthony and Liebman, 1995).
Показано,что белок Rps28 малой субчастицы контролирует эффективность считываниястоп-кодонов: мутации в гене, кодирующем этот белок, могут приводить как кповышению, так и к понижению эффективности нонсенс-супрессии (Anthonyand Liebman, 1995). Мутации в генах, кодирующих белки малой субчастицыRps9 (гомолог бактериального белка S4) и Rps2 (гомолог бактериального белка20S5), приводят к считыванию стоп-кодонов как значащих.
К такому же эффектуприводит делеция гена, кодирующего рибосомный белок большой субъединицырибосомы Rpl39p (см. Rospert et al., 2005). Недавно стало известно, чтогидроксилирование Rps23p (гомолог бактериального белка S12) по остаткупролина в 64-ом положении у Saccharomyces cerevisiae приводит к повышениюэффективности считывания стоп-кодона у одного гена (BSC4), и к понижениюэффективности — у другого гена (ADE1) (Loenarz et al., 2014). По всейвидимости, оксигеназа Tpa1p, катализирующая гидроксилирование Rps23p удрожжей, регулирует эффективность терминации трансляции в зависимости отконтекста (Loenarz et al., 2014).
Интересно, что добавление всего лишь одногоатома кислорода влияет на точность трансляции. Важно отметить, чтогидроксилированиеRps23pпроисходитвблизисайтовсвязываниястрептомицина и паромомицина.Долгое время переоценивали роль белков и недооценивали роль рРНК вконтроле считывания стоп-кодонов.
Теперь признаётся, что главная роль вобеспечении функций рибосомы, в том числе и в контроле точноститрансляции, принадлежит рРНК.Так,вструктурерРНКмалойсубчастицывыявленывысококонсервативные участки, необходимые для обеспечения точностидекодирования генетической информации (см. Rospert et al., 2005). Известно,что рибонуклеотиды, входящие в состав этих участков 18S рРНК у дрожжей,физически взаимодействуют с кодон-антикодоновыми комплексами, поэтомузамены этих рибонуклеотидов влияют на точность трансляции, в частности,приводят к считыванию стоп-кодонов (Pape et al., 1999; Velichutina et al., 2000;Velichutina et al., 2001).
Так, спираль 44 образует консервативный кордекодирующей зоны, в состав которой входят также спирали 18, 24, 31 и 34(Noller,2006).субчастицамиКорвовлеченрибосомы(см.в образованиеRospertetal.,контактов2005).междудвумяРибонуклеотиды,расположенные в пределах этих спиралей, физически взаимодействуют с кодонантикодоновыми комплексами; в них изолированы мутации, влияющие на21точность трансляции (Pape et al., 1999; Velichutina et al., 2000; Velichutina et al.,2001).Мутация rdn15 (A1491G), локализованная в 44 спирали 18S рРНК удрожжей, приводит к нарушению эффективности терминации трансляции иповышает чувствительность к паромомицину.
Мутация rdn15 приводит кобразованию участка со спаренными нуклеотидами C1409-G1491, которыйявляется аналогом известного участка связывания паромомицина с рибосомой убактерий. Таким образом, естественная высокая устойчивость дрожжевыхрибосом к паромомицину обусловлена, по-видимому, в значительной степениотсутствием этого участка спаренных нуклеотидов (Velichutina et al., 2001).Кроме того, мутация rdn15 способна компенсировать условную летальность,вызванную некоторыми мутациями в генах, кодирующих факторы терминациитрансляции eRF1и eRF3. На основании этих данных было высказанопредположение, что мутация rdn15 стимулирует фактор eRF1 более эффективнораспознавать стоп-кодоны (Velichutina et al., 2001). В спирали 27 выявленымутации rdn4, rdn6 и rdn8, повышающие эффективность терминациитрансляции.
При этом двойная мутация rdn4 rdn6 в комбинации с мутациями вгене SUP45 приводит к летальности, что указывает на то, что спираль 27 влияетна взаимодействие белка Sup45 с рибосомой.РибосомнаяРНКбольшойсубчастицырибосомытожеиграетсущественную роль в считывании стоп-кодонов. Мутация rdn5 в сарцинрициновой петле 25S рРНК в 3 раза увеличивает вероятность возникновенияошибок при синтезе полипептидной цепи и увеличивает устойчивость кпаромомицину (Liu and Liebman, 1996; Panopoulus et al., 2004). Известнымутации, затрагивающие 5S рРНК, которые могут приводить как к снижению,так и к повышению эффективности считывания стоп-кодонов (Smith et al.,2001). Различные биохимические и кристаллографические исследованияуказываютнато,функциональнымичто5SучасткамирРНКрРНКвзаимодействуетбольшойстимулирует присоединение аминоацил-тРНКссубъединицык рибосоме,различнымирибосомы,помогает в22определении топологии пептидил-трансферазного центра и усиливает егоактивность (Smith et al., 2001).
Таким образом, 5S рРНК может служить как«физический трансдуктор» информации между различными функциональнымицентрами рибосомы (Smith et al., 2001). Очевидно, что мутации в 5S рРНКдействительно могут существенно нарушать эффективность терминациитрансляции.Следует отметить, что гены, кодирующие рРНК, представлены большимколичеством копий, организованных в виде тандемных повторов.
Такаяизбыточность молекул рРНК обусловлена тем, что растущей клетке необходимозначительное число рибосом для обеспечения высокой скорости трансляции(см. Long and Dawid et al., 1980). В результате этого получение мутаций рРНКявляется сложной задачей, и подходы к их изучению требуют специальногоподхода. Для этого используют мультикопийные плазмиды, несущие по однойкопии рДНК, а соответствующие хромосомные локусы делетированы (см.Liebman et al., 1995; Smith et al., 2001).1.5.3.
Нонсенс-супрессия и факторы элонгацииВажную роль в контроле точности трансляции играют факторы элонгациитрансляции. Они принимают участие в поддержании рамки считывания и вобразовании «правильных» кодон-антикодоновых взаимодействий, а такжевлияют на эффективность считывания стоп-кодонов как значащих (Sandbakenand Culbertson, 1988; Carr-Schmid et al., 1999b).Фактор элонгации трансляции 1 (eEF1) состоит из двух субъединиц:eEF1A и eEF1B.
Фактор eEF1A, являющийся гомологом бактериальногофактора EF-Tu, у дрожжей-сахаромицетов кодируется двумя генами: TEF1 иTEF2, которые практически идентичны друг другу. Его функция состоит в ГТФзависимом связывании аминоацил-тРНК и доставке их в А-сайт рибосомы(Carvalho et al., 1984).23УвеличениеэффективностиколичествасвязываниябелкаeEF1Ааминоацил-тРНК,приводиткоторыекповышениюконкурируютсфакторами терминации трансляции, что может быть причиной повышенияуровня супрессии нонсенс-мутаций (Song et al., 1989).
Делеция гена TEF1 илиTEF2 проявляется противоположным образом: эффективность терминациитрансляции на стоп-кодонах повышается (см. Valente and Kinzy, 2003). Крометого, в гене TEF2 идентифицированы мутации, которые приводят к увеличениюколичества ошибок в процессе синтеза полипептидной цепи и повышениюэффективности нонсенс-супрессии и супрессии сдвигов рамки считывания(Sandbaken and Culbertson, 1988; Carr-Schmid et al., 1999a).
Несмотря на то, чтотакие мутации локализуются в разных участках гена TEF2, они, вероятно,нарушают ГТФазную активность eEF1A и способность связывать аминоацилтРНК.Диссоциация ГТФ до ГДФ, необходимая для высвобождения eEF1A изкомплексааминоацил-тРНК-рибосома,осуществляетсяфакторомобменануклеотидов eEF1B, который у дрожжей состоит из двух субъединиц: eEF1Bα иeEF1Bγ (см. Sasikumar et al., 2012). EF1Bα, кодируемый геном TEF5 у дрожжей,осуществляет обмен ГДФ на ГТФ в составе EF1A. Показано, что Стерминальный конец eEF1Bα, ответственный за обмен нуклеотидов, необходимдля связывания с eEF1A (Hiraga et al., 1993; Janssen and Möller, 1988; Jeppesen etal., 2003), а N-домен необходим для связывания с eEF1γ (Kinzy et al., 1994).eEF1γ, кодируемый у дрожжей генами TEF3 и TEF4, выполняет роль «якоря»,связывая eEF1B с эндоплазматической мембраной (Sanders et al., 1996).В отличие от eEF1A и eEF1Bα, фактор eEF1γ не является жизненноважным у дрожжей (Kinzy et al., 1994).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
