Диссертация (1145766)
Текст из файла
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИна правах рукописиРадченко Элина АлександровнаРОЛЬ ГЕНА SFP1 В КОНТРОЛЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ НОНСЕНССУПРЕССИИ У ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiaeспециальность 03.02.07 — генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководительд.б.н., профессор Л.Н.
МироноваСанкт-Петербург20142ОглавлениеСПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................................4ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫРОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В КОНТРОЛЕТОЧНОСТИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ............................................................71.1. Общая характеристика процесса трансляции у эукариот.............................71.2. Принцип поливариантности матричных процессов...................................121.2.1.
Неоднозначность трансляции.................................................................121.2.2. Типы ошибок при трансляции................................................................131.3. Генотипическая и фенотипическая супрессия.............................................141.4. Нонсенс-супрессия и антисупрессия как модели для изучениямолекулярных механизмов, контролирующих неоднозначность трансляции.141.5. Генетический контроль считывания стоп-кодонов у эукариот..................161.5.1. Считывание стоп-кодонов мутантными тРНК и тРНК дикого типа...161.5.2. Роль рРНК и рибосомных белков в нонсенс-супрессии......................181.5.3. Нонсенс-супрессия и факторы элонгации.............................................221.5.4.
Мутации по факторам терминации и считывание стоп-кодонов........251.5.5. Роль системы NMD в контроле нонсенс-супрессии............................301.5.6. Другие факторы, влияющие на эффективность считывания стопкодонов...............................................................................................................361.6. Эпигенетические факторы, влияющие на эффективность считываниястоп-кодонов...........................................................................................................401.6.1.
Прионный детерминант [PSI+]...............................................................411.6.2. Прионный детерминант [PIN+]...............................................................441.6.3. Прионный детерминант [NSI+]...............................................................461.6.4. Прионный детерминант [ISP+]...............................................................461.7. Заключение......................................................................................................49ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................512.1. Штаммы...........................................................................................................5132.2. Плазмиды.........................................................................................................522.3. Среды и условия культивирования...............................................................562.4.
Генетические методы.....................................................................................572.5. Молекулярно-генетические и биохимические методы...............................572.6. Биоинформационные и статистические методы..........................................63ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...........................................................................................663.1. Влияние детерминанта [ISP+] на экспрессию генов SUP35 и SUP45........663.1.1. Количество мРНК генов SUP35 и SUP45 в штаммах [ISP+], [isp-] иsfp1Δ....................................................................................................................663.1.2. Количество белков Sup35 и Sup45 в штаммах [ISP+], [isp-] и sfp1Δ....683.2. Сверхэкспрессия мутантной аллели гена SUP35 приводит кантисупрессии........................................................................................................713.3.
Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35 иsup45........................................................................................................................723.3.1. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup35. 733.3.2.
Анализ природы антисупрессии, вызванной повышеннойэкспрессией гена SFP1......................................................................................773.3.3. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию гена SUP35......803.3.4. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup45. 833.3.5. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию аллели дикоготипа и мутантных аллелей гена SUP45...........................................................883.4. Определение последовательности гена SFP1 в штамме 25-25-2В-П3982 ив плазмиде pRS426-SFP1......................................................................................903.5. Анализ продукции белков Sup35 и Sup45 в штамме, несущем делециюгена SFP1 или нормальную аллель этого гена....................................................93ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................96ВЫВОДЫ.................................................................................................................105СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................106БЛАГОДАРНОСТИ.................................................................................................1394СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙАТФ — аденозинтрифосфата.к.
– аминокислотаГТФ — гуанозинтрифосфатПЦР — полимеразная цепная реакцияПЦРРВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального временип.н. – пара нуклеотидовт.п.н. – тысяча пар нуклеотидовGuHCl – Guanidine hydrochloride (гидрохлорид гуанидина)ORF — open reading frame (открытая рамка считывания)UTR – untranslated region (нетранслируемая область)Вработеиспользованыобщепринятыенуклеотидов и нуклеиновых кислот.обозначенияаминокислот,5ВВЕДЕНИЕТрансляция — это один из базовых процессов, происходящих в клеткахживыхорганизмовиобеспечивающихихжизнедеятельность.Этотсложноорганизованный матричный процесс требует участия большого числамолекул и макромолекулярных комплексов различной природы (белков, мРНК,тРНК, рРНК, АТФ, ГТФ, рибосом и т.д.).
Нарушения в работе компонентоваппарата трансляции могут приводить к снижению или, наоборот, повышениюееточности,влияяначастотувозникновенияошибокприсинтезеполипептидной цепи.Одна из моделей для изучения генетического контроля точноститрансляции — изучение супрессии нонсенс-мутаций, в результате которой стопкодоны, возникшие мутационным путем в открытой рамке считывания, могутбыть прочитаны как значащие.Следует отметить, что около 30 % наследственных заболеваний человекаобусловлено наличием стоп-кодона в кодирующих последовательностях (см.Worton et al., 1992; см. Prat et al., 2005; см. Brooks et al., 2006; см. Stalder andMühlemann, 2008). В связи с этим исследование уже известных факторов какгенетической, так и эпигенетической природы, а также поиск и характеристикановых факторов, влияющих на эффективность супрессии нонсенс-мутаций, намодельномгенетическомобъекте,дрожжахSaccharomycescerevisiae,представляет собой актуальную задачу.Исследования такого рода проводятся в нашей лаборатории.
К числуактивно изучаемых генов, мутации которых приводят к нонсенс-супрессии,относятся гены SUP35 и SUP45, кодирующие факторы терминации трансляции(см. Inge-Vechtomov et al., 2003). Помимо генетических факторов, наэффективностьнонсенс-супрессиивлияютифакторыэпигенетическойприроды. Наиболее изученным примером такого рода у дрожжей являетсянаследственный детерминант [PSI+]. Он представляет собой прионную форму6фактора терминации трансляции eRF3, кодируемого геном SUP35 (см. Галкин идр., 2006). Переход активной формы фактора терминации eRF3 в неактивную,прионную, способствует считыванию стоп-кодонов как значащих, поэтомуштаммы [PSI+] проявляют нонсенс-супрессорный фенотип.Внашейлабораториибылидентифицированновыйприонныйдетерминант [ISP+]. [ISP+] также влияет на считывание стоп-кодонов, нопротивоположным,посравнениюс[PSI+],образом:проявляетантисупрессорный эффект по отношению к некоторым мутациям sup35 (Volkovet al., 2002).
При открытии [ISP+] было изначально предположено, что онявляется одной из формой приона [PSI+] (Волков и др., 2000), однако, этагипотезанеподтвердилась.Впоследствиибылопоказано,что[ISP+]представляет собой продукт прионизации транскрипционного фактора Sfp1(Rogoza et al., 2010). Сверхэкспрессия гена SFP1 приводит к индукции [ISP+], аделеция — к потере этого детерминанта (Rogoza et al., 2010). Помимо этого, внашей лаборатории было отмечено, что сверхэкспрессия SFP1 также проявляетсобственный антисупрессорный эффект, не связанный с возникновением [ISP+],а делеция приводит к повышению эффективности нонсенс-супрессии.Механизм, посредством которого [ISP+] и изменение уровня экспрессии генаSFP1 влияют на эффективность нонсенс-супрессии, оставался неясным.Дальнейшему исследованию роли гена SFP1 в контроле эффективностинонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae посвящена настоящаяработа.7ГЛАВА 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫРОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ВКОНТРОЛЕ ТОЧНОСТИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ1.1. Общая характеристика процесса трансляции у эукариотТрансляция — это многоступенчатый процесс, в процессе которогоосуществляется синтез белка из аминокислот на матрице информационной, илиматричной, РНК. Трансляция осуществляется при помощи сложной белоксинтезирующей системы и состоит из следующих стадий: инициации,элонгации, терминации синтеза полипептидной цепи, а также рециркуляциирибосом (см. Ramakrishnan, 2002; cм.
Marintchev and Wagner, 2004).Белоксинтезирующий аппарат клетки состоит из большого количестваразличных компонентов, таких как рибосомы, мРНК, тРНК, аминоацил-тРНКсинтетазы, белковые факторы трансляции, АТФ и ГТФ. Молекулярнойплатформой, на которой осуществляется взаимодействие мРНК, тРНК, ибелковых факторов трансляции, является рибосома.Рибосомапредставляетсобойрибонуклеопротеиновуюструктуру,состоящую из 2 субъединиц: малой (40S) и большой (60S). В структуре рибосомвыделяют 3 функционально-важных участка: A-сайт — акцепторный, P-сайт —пептидильный, или донорный (D-), и Е-сайт (см.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
