Диссертация (1145766), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Проанализировать влияние прионной формы белка Sfp1, детерминанта[ISP+], на экспрессию генов SUP35 и SUP45;2. Исследовать влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявлениенонсенс-супрессорных мутаций sup35 и sup45;3. Изучить влияние сверхэкспрессии и делеции гена SFP1 на экспрессиюгенов SUP35 и SUP45.51ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. ШтаммыГенотипы штаммов дрожжей Saccharomyces сerevisiae, использованных вработе, приведены в таблице 1.Также в работе был использован бактериальный штамм Escherichia сoliDH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1(Hanahan, 1985; Bethesda Research Laboratories, 1986).Таблица 1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные вработе.НазваниеГенотипПроисхождениештамма1А-Д1628MATα ade1-14 his3 lys2 ura3-52 trp1-289 Moskalenko et al.,leu2-3,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP45] 200321-Д863MATα ade1-14 his7-1 lys2-90 ura3-52 Задорский и др.,trp1-289 leu2-3,1122003SUP35::TRP1 [pYCHU2]1Б-Д1606МАТα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289 Moskalenko et al.,ura3-52 leu2-3,112sfp1Δ-1Б-Д16062003МАТα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289 А.Б.
Данилова (неura3-52 leu2-3,112 sfp1Δопубликовано)МАТα ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ leu2- Volkov et al., 200225-25-2В-П3982* 1 thr4-B15 sup35-25 sup45-400 [ISP+] и[isp-]sfp1Δ-25–25-2В- МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ leu2- Rogoza et al., 2010П3982**1 thr4-B15 sup35-25 sup45-400 sfp1Δ[isp-]Примечания: Плазмида pRS316-SUP45 несет аллель дикого типа гена SUP45 икомпенсирует летальный эффект дизрупции хромосомной копии гена SUP45 в52штамме 1А-Д1628.
Плазмида pYCHU2 несет аллель дикого типа гена SUP35 икомпенсирует летальный эффект дизрупции гена SUP35 в штамме 21-Д863.* — полное название этого штамма 25-25(-ду8-132-Л28)-2В-П3982. В работеиспользовалось его сокращённое название.** — делеция гена SFP1 была получена у штамма 25-25-2В-П3982 [isp-].В таблице использованы традиционные обозначения мутаций. Нонсенсмутации ade1-14 (UGA), his7-1 (UAA), thr4-B15 (UGA) и trp1-289 (UAG)приводят к ауксотрофности по аденину, гистидину, треонину и триптофанусоответственно; мутации lys9-A21 (UAA), lys2-87 (UGA) и lys2-90 (UGA)приводят к ауксотрофности по лизину (lys2-90 (UGA) — мутация, приводящаяк сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодона в кодирующей областигена LYS2 (Куликов и др., 2001).
Мутации ura3-52, his3, leu2-1 и leu2-3,112приводят к ауксотрофности по урацилу, гистидину и лейцину соответственно.Мутация ura3Δ представляет собой делецию гена URA3; sup35-25 –рецессивная омнипотентная супрессорная мутация в гене SUP35 (Volkov et al.,2002), sup45-400 — криптическая мутация в гене SUP45, не имеющаясобственного проявления, но влияющая на фенотипическое проявление [ISP+](Аксенова и др., 2006).2.2. ПлазмидыДля конструирования штаммов, несущих мутантные аллели sup35, былииспользованы центромерные плазмиды серии pRSU1, несущие ген LEU2 вкачестве селективного маркера (Volkov et al., 2002).
Физическая карта этихплазмид представлена на рисунке 4. Внутри серии плазмиды различалисьаллелями гена SUP35 (Chabelskaya et al., 2004, Volkov et al., 2002),характеристика которых представлена в таблице 2. Эти плазмиды былипредоставлены в наше распоряжение Д. А. Киктевым (Санкт-Петербургский53Государственный университет).ampRCEN6SUP35pRSU110716 п.н.ARSH4LEU2Рисунок 4. Физическая карта плазмид серии pRSU1.SUP35 — дрожжевой ген SUP35; LEU2 — дрожжевой ген LEU2; ARSH4 —дрожжевой ориджин репликации; CEN6 — участок дрожжевой центромеры;ampR — бактериальный ген устойчивости к ампициллину.Таблица2.ПлазмидысерииpRSU1,использованныевработе,ихарактеристика аллелей sup35, содержащихся в этих плазмидах.ПлазмидаpRSU1pRSU1-10pRSU1-25pRSU1-228pRSU1-240АллельНуклеотиднаяАминокислотнаязамена,SUP35SUP35sup35-10sup35-25sup35-228sup35-240заменаC1133TG1087AG1115AC166Tтип мутации378Thr → Ile (миссенс)363Asp → Asn (миссенс)372Arg→Lys (миссенс)56Gln→UAA (стоп)Для конструирования серии штаммов, несущих различные мутации в генеSUP45, была использована серия плазмид — производных плазмиды pR315(Sikorski and Hieter, 1989), несущих мутантные аллели и аллель дикого типагена SUP45, а также ген LEU2 в качестве селективного маркера.
Эта серияплазмидбылапредоставленаС. В. Москаленко(Санкт-ПетербургскийГосударственный Университет) (Le Goff et al., 2002; Moskalenko et al., 2003;54Москаленко и др., 2004) (рисунок 5). Обозначения плазмид и молекулярнаяприрода проклонированных в их составе аллелей sup45 представлены в таблице3.CEN6ARSH4ampRLEU2pRS315-SUP459911 п.н.SUP45Рисунок 5. Физическая карта плазмид серии pRS315-SUP45.SUP45 — дрожжевой ген SUP45; LEU2 — дрожжевой ген LEU2; ARSH4 —дрожжевой ориджин репликации; CEN6 — участок дрожжевой центромеры;ampR — бактериальный ген устойчивости к ампициллину.Таблица 3. Характеристика аллелей SUP45, содержащихся в плазмидах серииpRS315.НазваниеАллель гена НуклеотиднаяАминокислотная замена, типплазмидыpRS315-SUP45SUP45заменамутацииSUP45pRS315-101pRS315-102pRS315-103pRS315-104pRS315-105pRS315-107pRS315-116--sup45-101sup45-102sup45-103sup45-104sup45-105sup45-107sup45-116G796TT159AT62CT848АG1153TT950GG185C266Glu→UAA (стоп)53Tyr→UAA (стоп)21Leu→Ser (миссенс)283Leu→UAA (стоп)385Glu→UAA (стоп)317Leu→ UGA (стоп)62Arg→Thr (миссенс)55СверхэкспрессиягенаSFP1достигаласьприиспользованиимультикопийной плазмиды pRS426-SFP1 (получена С.
А. Родионовой, СанктПетербургскийГосударственныйУниверситет);вкачествеконтроляиспользовали плазмиду pRS426 (Christianson et al., 1992). Физические картыэтих плазмид представлены на рисунке 6.АБ2micron ori2micron oriURA3URA3pRS4265726 п.н.ampRampRpRS426-SFP18885 п.н.LacZSFP1Рисунок 6.
Физическая карта плазмид pRS426 (A) и pRS426-SFP1 (Б).SFP1 – дрожжевой ген SFP1; URA3 — дрожжевой ген URA3; LacZ бактериальный ген, кодирующий β-галактозидазу; 2micron ori — ориджинрепликации 2μ ДНК; ampR — бактериальный ген устойчивости к ампициллину.Сверхэкспрессиямутантнойаллелиsup35-25достигаласьприиспользовании мультикопийной плазмиды PRSU3-25 (Volkov et al., 2002),(рисунок 7, А). В качестве контроля использовали исходный вектор pRS425(Christianson et al., 1992), (рисунок 7, Б).56АБ2micron oriLEU2LEU2SUP35pRSU3-2511548 п.н.pRS4256849 п.н.ampR2micron oriLacZampRРисунок 7.
Физическая карта плазмид pRSU3-25 (A) и pRS425 (Б).SUP35 – дрожжевой ген SUP35; LEU2 — дрожжевой ген LEU2; LacZ бактериальный ген, кодирующий β-галактозидазу; 2micron ori — ориджинрепликации 2μ ДНК; ampR — бактериальный ген устойчивости к ампициллину.2.3. Среды и условия культивированияВ работе использовали стандартные культуральные среды, применяемыепри работе с дрожжами (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986):полную среду YEPD (от англ. Yeast Extract Peptone Dextrose), селективныеминимальные среды (SD) (Synthetic Dextrose), полную и селективныесинтетические среды SC (от англ. Synthetic Complete) на основе YNB (от англ.Yeast Nitrogene Base).
Также в работе была использована среда SC, содержащая5-фтороротовуюкислоту(FOA)(фирма-производитель«Angus»)вконцентрации 1мг/мл (Kaiser et al., 1994). Для неселективной детекцииауксотрофности по аденину применяли среду ¼ YEPD (Eaglestone et al., 2000)Для выращивания бактерий использовали среду LB (Sambrook et al.,1989). Трансформантов E.
coli отбирали на среде LB с добавлениемампициллина в концентрации 50 мкг/мл (LBA).57Штаммы дрожжей выращивали при температуре 26оС, штаммы бактерий- при 37оС.2.4. Генетические методыВ работе использовали стандартные методы, применяемые при работе сдрожжами: метод селективных сред для анализа ауксотрофности штаммов,методотпечатков,субклонированиеиотборсубклоновприпосевеистощающим штрихом (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986; Kaiser et al.,1994).Длясравненияупорядоченныйпосевэффективностиштаммовнонсенс-супрессиидрожжейнаселективныеприменялисредысиспользованием серий последовательных разведений суспензии клеток.
Дляэтого клетки со штриха на твердой среде ресуспендировали в стерильнойдистиллированной воде, измеряли оптическую плотность (OD = 595) идоводили все пробы приблизительно до концентрации 10 7 клеток/мл. Послеэтого по 6 мкл суспензии клеток каждого изучаемого штамма высевали наполную и селективные среды в серии пятикратных последовательныхразведений. Такой метод обладает более высокой разрешающей способностью,чемметодотпечатков,посколькупозволяетрегистрироватьдаженезначительные различия в фенотипах штаммов.2.5. Молекулярно-генетические и биохимические методыВ работе использовались стандартные методы молекулярной генетики ибиохимии: выделение плазмидной ДНК из E.
coli, выделение геномной ДНК изS. cerevisiae,амплификацияфрагментовхромосомнойДНКметодомполимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции врежиме реального времени для оценки уровня экспрессии генов (ПЦРРВ),выделение и электрофорез белков в полиакриламидном геле (Kushnirov et al.,582006) и иммуноблоттинг для оценки количества белков в лизатах клеток(Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994).Трансформацию E. coli проводили в соответствии с методом Иноу сизменениями (Inoue et al., 1990), трансформацию дрожжей — по методу Гица сиспользованием ацетата лития и балластной ДНК (Gietz et al., 1992; Gietz andWoods, 2006), с модификациями.Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора реактивовGeneJetPlasmidMiniprepKit(«Fermentas»),согласноинструкциямпроизводителя.
Определение концентрации выделенной ДНК и выравниваниепроб для упорядоченного посева штаммов дрожжей осуществляли с помощьюспектрофотометров (Bio-Rad SmartSpec Plus Spectrophotometer и Bio-Rad iMarkMicroplate Absorbance Reader), согласно инструкциям производителя.Выделение геномной ДНК из дрожжей проводили по методике,описанной в статье Kaiser et al., 1994, со следующими изменениями: дляосажденияиспользовалиэтанол,арастворялиполученнуюДНКвдеионизированной воде.Для оценки собственного эффекта сверхэкспрессии SFP1 мы проводилиэлиминацию мультикопийных плазмид pRS426 и pRS426-SFP1 из клетоктрансформантов, проводя пассирование клеток на среде, содержащей FOA, дляштамма, несущего sup45-116, и на среде YEPD для всех остальных штаммов.Для исследования площади клеток штамм инкубировали в жидкой средеприпостоянномперемешивании(26 ºC,180об/мин)додостижениястационарной фазы роста, после чего изготавливали временный препаратсуспензии клеток в камере Горяева.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
