Диссертация (1145766), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Этот штамм мы трансформировали плазмидами серииpRSU1, несущими мутантные аллели SUP35: sup35-10 и sup35-25, на фонекоторых ранее показано возникновение и фенотипическое проявление [ISP+], нов присутствии криптических мутаций sup45; sup35-228, несущую миссенсмутацию, приводящую к аминокислотной замене, близкой по расположению кзаменам, содержащимся в аллелях sup35-25 и sup35-10; sup35-240, несущуюнонсенс-мутацию, затрагивающую N-домен белка Sup35. Характеристика этихаллелей приведена в таблице 2 (см. раздел «Материалы и методы») и на рисунке13.sup35-240Gln56стоп (UAA)Nsup35-10Asp363AsnMsup35-228Arg372Lyssup35-25Thr378IleCРисунок 13. Локализация использованных в работе мутаций в гене SUP35,приводящих к указанным аминокислотным заменам.
Символами «N», «M» и«С» обозначены участки гена, кодирующие соответствующие домены белкаSup35.Отбор трансформантов плазмидами, несущими мутантные аллели генаSUP35, проводили на среде, не содержащей лейцин. После этого отбирали по 4трансформанта каждой плазмидой и пассировали на среде YEPD, добиваясьпотери плазмиды pYCHU2, несущей аллель SUP35 дикого типа. Отсутствиеплазмиды pYCHU2 подтверждали по отсутствию роста на среде, несодержащей урацил. Здесь и далее для анализа фенотипа полученных штаммов75применяли метод отпечатков и посева с разведениями. Поскольку штамм 21Д863 несет маркерные мутации ade1-14, his7-1 и lys2-90, характеристикуфенотипа трансформантов проводили на средах, не содержащих аденин,гистидин или лизин (рисунок 14).Рисунок 14.
Наличие плазмиды с мутантными аллелями SUP35 приводит ксупрессии мутаций ade1-14, his7-1, lys2-90, в отличие от плазмиды, несущейSUP35 дикого типа. Штамм, несущий плазмиду с геном SUP35 дикого типа,обозначен как «д.т.»; штаммы, несущие плазмиды с мутантными аллелямиsup35-10, sup35-25, sup35-228, sup35-240, обозначены цифрами 10, 25, 228 и240, соответственно. Здесь и далее представлены пять последовательныхпятикратных разведений (концентрация клеток уменьшается слева направо).Таким образом, все использованные мутантные аллели гена SUP35характеризуются нонсенс-супрессорным эффектом по отношению к мутациямade1-14, his7-1, lys2-90. Следовательно, полученные трансформанты могут бытьиспользованы для изучения влияния повышенной экспрессии гена SFP1 наэффективность нонсенс-супрессии. После этой проверки штаммы, несущиемутации sup35 на плазмиде pRSU1, трансформировали мультикопийнымиплазмидами pRS426-SFP1 и pRS426 (в качестве контроля).
Для дальнейшегоанализа в каждой комбинации отбирали не менее 100 трансформантов. Далеетрансформантов оценивали по эффективности супрессии методом отпечатковна селективные среды, а в некоторых случаях, в целях дополнительнойпроверки, методом посева с разведениями. Мы обнаружили, что у всех76трансформантов происходит снижение эффективности нонсенс-супрессии присверхэкспрессии SFP1 (рисунок 15). Правда, все исследованные штаммы в тойилиинойстепенидемонстрировалиснижениескоростиростаприсверхэкспрессии SFP1, поэтому в некоторых комбинациях нонсенс-мутаций имутаций sup35 ослабление роста было обусловлено, по-видимому, обеимипричинами.
Тем не менее, в некоторых комбинациях супрессорной исупрессируемой мутаций, как, например, sup35-240 и ade1-14, снижениеэффективности супрессии было очевидно и само по себе.Рисунок 15. Наличие мультикопийной плазмиды pRS426-SFP1 приводит кснижению эффективности супрессии мутаций ade1-14, his7-1, lys2-90 вштаммах, несущих различные аллели SUP35, в отличие от плазмиды pRS426.Знаком «Ø» здесь и далее обозначена контрольная плазмида pRS426; плазмидаpRS426-SFP1 обозначена как «↑SFP1».Такимобразом,сверхэкспрессияSFP1приводиткснижениюэффективности супрессии, вызванной различными по своей природе (нонсенси миссенс-) мутациями sup35.773.3.2.
Анализ природы антисупрессии, вызванной повышеннойэкспрессией гена SFP1Как отмечено ранее, повышенная экспрессия SFP1 может вызыватьантисупрессию, не связанную с образованием приона [ISP+]. Об этом говориттот факт, что после элиминации плазмиды, несущей SFP1, у части отбираемыхклонов детектируется восстановление супрессорного фенотипа (Rogoza et al.,2010).ВслучаесверхэкспрессиейжевозникновенияприонаSFP1, антисупрессорный[ISP+],эффектсвязанногосохраняетсяисопривосстановлении нормального уровня экспрессии SFP1 после элиминацииплазмиды. Для того чтобы выяснить, обусловлено ли изменение фенотипаклонов, несущих мутации sup35, трансформированных плазмидой, содержащейSFP1, увеличением копийности этого гена или оно является следствиемвозникновения в таких клетках прионной формы Sfp1p, мы элиминировалиплазмиду pRS426-SFP1, пассируя клетки на полной среде YEPD. После отборавыросших колоний и проверке их фенотипа убеждались в отсутствии в клеткахплазмиды pRS426-SFP1 по отсутствию роста на среде, не содержащей урацил.Дальнейший анализ клонов, потерявших плазмиду, несущую SFP1,показал, что супрессорный фенотип восстановился у всех отобранных клонов,несущих мутации sup35-240, sup35-25, sup35-228 (в каждом случае былопроанализировано не менее 60 клонов).
На рисунке 16 приведены типичныеклоны, иллюстрирующие эти данные.Таким образом, сверхэкспрессия гена SFP1 в случае штаммов, несущихмутации sup35-240, sup35-25, sup35-228, приводит к снижению эффективностинонсенс-супрессии, не связанному с возникновением прионного детерминанта[ISP+].78Рисунок 16. Супрессорный эффект мутаций sup35-25, sup35-228, sup35-240восстанавливается после потери мультикопийной плазмиды с геном SFP1. Здесьи далее элиминация плазмид, которые содержались в клетках исследованныхштаммов, отражена путем перечеркивания их названий.Вместе с тем, в случае штамма, несущего мутацию sup35-10, несколькоклонов (4 из 100 проанализированных) сохранили несупрессорный фенотиппосле потери плазмиды. На рисунке 17 представлено по одному клону обоихтипов (восстановивших фенотип Sup+ после элиминации плазмиды исохранивших фенотип Sup-).Рисунок 17.
Несупрессорный фенотип сохраняется у некоторых клонов,несущих sup35-10, после потери плазмиды, несущей SFP1.(1) — клон, утративший плазмиду pRS426, (2) – клон, утративший плазмидуpRS426-SFP1 и восстановивший фенотип Sup+, (3) – клон, утратившийплазмиду pRS426 и сохранивший фенотип Sup-..Известно, что одной из функций гена SFP1 является контроль размераклеток.
Ранее показано, что размер клеток штамма, несущего делецию генаSFP1, на 40% меньше, чем размер клеток штамма, несущего нормальную79аллель SFP1 (Jorgensen et al., 2002). В работах нашей группы показано, чторазмер клеток штамма [ISP+] несколько превышает размер клеток штамма [isp-](Rogoza et al., 2010). В связи с этим, мы решили проверить, отличаются ли поразмеру клеток клоны, предположительно содержащие [ISP+], от клонов,прошедших через процедуру пассирования на среде с GuHCl. Мы обнаружили,что размер клеток до и после пассирования на среде с GuHCl статистическизначимо различается (рисунок 18). Выборки сравнивали по критериюВилкоксона-Манна-Уитни с поправкой Бонферрони при p<0.001.*********Рисунок 18.
Средняя площадь клеток исходного штамма, несущего sup35-10(1), клона, сохранившего фенотип Sup- после элиминации плазмиды pRS426SFP1 (2) и восстановившего фенотип Sup+ после пассирования на среде сGuHCl (3). Приведены ошибки средних. *** - p<0.001.Эти данные также подтверждают вывод о том, что в штамме, несущеммутацию sup35-10, временное повышение экспрессии гена SFP1 привело квозникновению наследственного детерминанта, схожего по своему проявлению80с прионом [ISP+]. Поскольку использованные нами штаммы содержали аллельдикого типа SUP45, это означает, что возникновение [ISP+] возможно и вотсутствие криптических мутаций в гене SUP45.Вместе с тем, нельзя исключить, что появление [ISP+] в части клеток,сверхэкспрессирующих SFP1, стало возможным благодаря возникновениюкриптических мутаций sup45, подобных sup45-400 и sup45-75.
В связи с этимнужно было проанализировать нуклеотидную последовательность гена SUP45из клонов, в которых [ISP+] возник на фоне мутации sup35-10. Анализпоследовательности SUP45 из двух клонов, сохранивших фенотип Sup- послепотеримультикопийнойплазмиды,показалотсутствиеотличийотопубликованной последовательности гена SUP45 дикого типа штаммовПетергофских генетических линий (Mironova et al., 1995).На основании этих результатов можно сделать вывод, что возникновениеприона [ISP+] возможно и в отсутствие специфических мутаций в гене SUP45,однако эффективность образования приона в этом случае, по-видимому, ниже,чем в случае комбинаций мутаций sup35-25 и sup45-400, либо sup35-10 и sup4575.Такимобразом,мыпоказали,чтопроявлениемутацийsup35модифицируется при сверхэкспрессии SFP1, причем эта модификация, можетбыть обусловлена как прионизацией белка Sfp1, так и сверхпродукцией егонормальной изоформы.
В обоих случаях эта модификация проявляется нафенотипическом уровне как снижение эффективности нонсенс-супрессии.3.3.3. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию гена SUP35Ранее мы показали (см. пункт 3.1. главы «Результаты»), что в присутствиидетерминанта [ISP+] уровень транскрипции гена SUP35 и продукции белкаSup35 выше, чем в штамме [isp-]. Сходство фенотипических эффектов [ISP+] и81повышенной продукции белка Sfp1 позволяет предположить, что в штаммах[isp-], сверхпродуцирующих Sfp1р, экспрессия гена SUP35 также повышена.Для сравнения уровня экспрессии SUP35 при повышенной экспрессии и принормальном уровне экспрессии SFP1, мы использовали штамм 21-Д863,несущий аллель гена SUP35 дикого типа.
Этот штамм был трансформированплазмидой pRS426-SFP1 и pRS426 в качестве контроля. Было отобрано 100трансформантов каждого штамма. Оценка количества мРНК гена SUP35,проведенная с помощью ПЦР в режиме реального времени, показала, что ееколичество в клетках, сверхэкспрессирующих SFP1, увеличено по сравнению cконтролем (мРНК из клеток, трансформированных плазмидой pRS426)(рисунок 19). Этот результат воспроизводился в каждой из трех повторностей,однако из-за большого разброса значений порогового цикла в случае различныхбиологических повторностей, подтвердить эти данные статистически неудалось. Очевидно, в этом случае требуется большее, чем обычно, количествоповторностей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
