Диссертация (1145766), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Следуетотметить, что эффекты повышенной экспрессии гена SFP1 мы изучали,используя плазмиду pRS426-SFP1, при этом ген SFP1 был клонирован в эту91плазмиду из геномной ДНК штамма 25-25-2В-П3982 (Rogoza et al., 2010). Всвязи с этим нельзя было исключить, что фенотипические эффекты,обусловленные сверхэкспрессией SFP1 в наших экспериментах, могут бытьсвязаны со спецификой нуклеотидной последовательности использованнойаллели SFP1 и, соответственно, с особенностями первичной структуры белкаSfp1.
Для проверки этой возможности мы секвенировали аллель SFP1,клонированнуювплазмидеpRS426-SFP1,исравнилиполученнуюпоследовательность с последовательностью гена SFP1 из штамма S288C. Мыобнаружили, что сравниваемые последовательности различаются по восьмипозициям, три из которых не влияют на смысл триплетов, а пять обусловливаютразличия в аминокислотной последовательности белков, синтезируемых подконтролем этих аллелей (таблица 6).Таблица6.Результатысеквенированияиположениевариацийвпоследовательности гена SFP1.Порядковый Положение в Нуклеотидная ВариацияномерORFгена вариациятриплетевариацииSFP1(S288C→25-252В-П3982)в Аминокислотнаявариация198T→CTTT→TCTPhe→Ser2221T→CATG→ACGMet→Thr3322C→TCAT→TATHis→Tyr4404A→GAAT→AGTAsn→Ser5410T→CATT→ACTIle→Thr6873C→TACC→ACTThr71056C→TTCC→TCTSer81761C→TCTC→CTTLeuМыпроанализировалирасположениенуклеотидныхвариаций,приводящих к замене аминокислот в белке Sfp1.
Для этого использовалипрограммуMotifscan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan),котораявыявляет предполагаемые домены анализируемого белка. Дальнейший анализ92этих вариаций показал, что три из этих точек не затрагивают известные илипредполагаемые функциональные сайты в белке Sfp1.
Две вариации, T98C иT221, приводящие к замене неполярных гидрофобных Phe и Met на полярныенезаряженные Ser и Thr соответственно, локализованы в участке, обогащенномAsn. По аналогии с другими прионными белками дрожжей, можнопредположить, что именно этот участок отвечает за прионизацию Sfp1р(рисунок 27).Рисунок 27. Предполагаемая структура белка Sfp1.Asn – потенциально прионогенный домен, участок белка Sfp1, обогащенныйAsn;Zn – домен «Цинковые пальцы»;Asn-Gln–потенциальноприоногенныйдомен,участокбелкаSfp1,обогащенный Asn и Gln;(!) и (?) – статус белка;1– порядковый номер вариации (от 1 до 8) (см. таблицу 6);P– сайт фосфорилирования, имеющий важную роль в локализации Sfp1 (поLempianen et al., 2009)Таким образом, использованная нами аллель SFP1 действительнокодирует белок, имеющий отличия в аминокислотном составе потенциально93прионогенного домена от белка, синтезированного под контролем другихаллелей того же гена.
Могут ли наблюдаемые эффекты быть связаны с этимиотличиями? По-видимому, нет. Об этом говорят полученные ранее в работахнашей группы данные, согласно которым экспрессия SFP1 с плазмиды pSFP1GFP также приводит к индукции детерминанта [ISP+] и антисупрессорномуэффекту (Rogoza et. al., 2010). Аллель SFP1, содержащаяся в этой плазмиде,клонирована из штамма W303, происходящего от штамма S288C (Xu and Norris,1998). Таким образом, особенности аминокислотной последовательности белкаSfp1 в штаммах ПГЛ не являются причиной наблюдаемых эффектов.3.5. Анализ продукции белков Sup35 и Sup45 в штамме, несущем делециюгена SFP1 или нормальную аллель этого генаПри исследовании роли гена SFP1 в поддержании детерминанта [ISP+],было обнаружено, что помимо необратимой элиминации [ISP+], делеция SFP1сама по себе приводит к слабой нонсенс-супрессии (Rogoza et al., 2008).
Судяпо данным, полученным при сравнении штаммов, несущих делецию SFP1 илинормальную аллель этого гена, Sfp1p позитивно регулирует экспрессию геновSUP35 и SUP45 (Jorgensen et al., 2002). Кроме того, как мы уже показали,количество белков Sup35 и Sup45 в штамме 25-25-2B-П3982, несущем делециюSFP1, снижено (см. раздел 3.1.2.). Вероятно, это является причиной повышенияэффективности считывания стоп-кодонов как значащих, что проявляется нафенотипическом уровне как нонсенс-супрессия.Необходимо отметить, однако, что в упомянутом выше экспериментеиспользовался штамм, несущий нонсенс-супрессорную мутацию sup35-25.Поэтому наблюдаемые эффекты отражают модификацию фенотипическогопроявления мутантной аллели, нарушающей терминацию трансляции.
Дляболее полной характеристики эффектов делеции гена SFP1, было интереснопосмотреть, как делеция SFP1 влияет на экспрессию генов SUP35 и SUP45 в94отсутствие мутаций в этих генах. С этой целью был использован штамм 1БД1606, несущий делецию гена SFP1 и нонсенс-мутации ade1-14 (UGA), his7-1(UAA), lys9-A21 (UAG) и trp1-289 (UAG). После этого сравнили фенотипыисходного штамма и штамма с делецией гена SFP1. Эффективность супрессииоценивали методом посева с разведениями. Мы обнаружили, что делеция SFP1приводит к нонсенс-супрессии по отношению ко всем четырем нонсенсмутациям (рисунок 28).Рисунок 28.
Делеция гена SFP1 (здесь и далее обозначено как «sfp1∆»)приводит к повышению эффективности супрессии мутаций ade1-14, his7-1,lys9-A21 и trp1-289 по сравнению со штаммом, несущим нормальную аллельгена SFP1 (здесь и далее обозначено как «SFP1»).Затем мы показали, что нонсенс-супрессорный эффект делеции гена SFP1связан со снижением уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45.
Это былопоказано как в отношении мРНК, транскрибируемой с этих генов (рисунок 29),так и в отношении белков Sup35 и Sup45 (рисунок 30).95Рисунок 29. В штамме 1Б-Д1606, несущем делецию SFP1 (обозначено как«sfp1∆»), количество мРНК генов SUP35 (А) и SUP45 (Б) снижено посравнению со штаммом, несущем нормальную аллель SFP1 (обозначено как«SFP1»). * - различия статистически значимы (p < 0,05, критерий ВилкоксонаМанна-Уитни).Рисунок 30. Делеция гена SFP1 (обозначено как «sfp1∆») приводит к снижениюколичества белков Sup35 и Sup45 по сравнению со штаммом, несущимнормальную аллель гена SFP1 (обозначено как «SFP1»).96ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕТерминация трансляции полипептидной цепи на рибосоме представляетсобой один из базовых этапов реализации генетической информации. Удрожжей изменение эффективности этого процесса может быть достаточнолегко детектировано по росту штаммов, несущих нонсенс-супрессорныемутации, на различных селективных средах.
На эффективность терминациитрансляции могут влиять факторы различной природы, как генетические, так иэпигенетические. К числу эпигенетических факторов можно отнести прионнуюконформацию белков, так или иначе участвующих в терминации трансляции.Один из таких факторов – прионный детерминант [ISP+], обнаруженный иохарактеризованный в нашей лаборатории (Volkov et al., 2002).Детерминант[ISP+]былидентифицированкакнеменделевскийхромосомный фактор, проявляющий антисупрессорный эффект по отношениюк некоторым мутациям в гене, кодирующем фактор терминации трансляцииSup35 (eRF3) (Volkov et al., 2002).
При этом [ISP+] обладает рядом характерныхдля прионов дрожжей свойств: нехромосомный характер наследования,доминантное проявление, излечивание на среде, содержащей хлорид гуанидина,и повторное спонтанное возникновение, а также способность к передаче прицитодукции. Вместе с тем, [ISP+] по многим параметрам отличается от другихдрожжевых прионов: у него очень высокая частота спонтанного возникновения,его поддержание не зависит от шаперона Hsp104p, он локализуется в ядре ихуже «лечится» GuHCl (Volkov et al., 2002; Rogoza et al., 2010).При дальнейшем исследовании [ISP+] было выявлено, что он являетсяпродуктом прионного превращения белка Sfp1.
Об этом говорили следующиефакты: делеция гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [ISP+];введение SFP1 на центромерной плазмиде восстанавливает возможностьспонтанноговозникновения[ISP+]сверхэкспрессияSFP1существенно97+повышает частоту индукции [ISP ]; в клетках [ISP+] белок Sfp1 находится вчастично агрегированном состоянии (Rogoza et al., 2010).Oдна из наиболее интересных характеристик [ISP+] заключается в том,что штамм [ISP+] отличается по фенотипу не только от штамма [isp-], но и отштамма sfp1Δ, хотя считается, что последствия прионизации белков и делецииих структурного гена должны быть идентичны (Wickner, 1994). Все эти фактыговорят о необходимости дальнейших исследований роли гена SFP1 в контролетерминации трансляции. Поскольку белок Sfp1 – это транскрипционныйфактор, мы предположили, что фенотипический эффект [ISP+] можно объяснитьразличиями в уровне экспрессии генов-мишеней, вовлеченных в контрольтерминации трансляции.
Факторы терминации трансляции Sup35 (eRF3) иSup45 (eRF1) являются наиболее вероятными посредниками антисупрессорногоэффекта детерминанта [ISP+], поскольку известно, что изменение уровняэкспрессии генов SUP35 и SUP45 влияет на эффективность терминациитрансляции. В связи с этим мы предприняли изучение эффектов прионизациибелка Sfp1, а также сверхпродукции и отсутствия нормальной изоформы этогобелка, на проявление мутаций и уровень экспрессии генов SUP35 и SUP45.Действительно, с помощью полимеразной цепной реакции в режимереального времени (ПЦРРВ) мы показали, что транскрипция гена SUP35 вышев штамме [ISP+] и снижена в штамме sfp1Δ по сравнению с контролем —штаммом [isp-]. При этом уровень транскрипции гена SUP45 в штамме [ISP+]изменяется в противоположную сторону, хоть и незначительно.Известно, что изменения в уровне транскрипции генов не всегда приводятксоответствующемуизменениюколичестваихбелков.Чтобыпроанализировать уровень продукции белков Sup35p и Sup45p, мы провеливестерн-блот анализ, который показал, что изменения количества этих белковсопоставимы с изменениями в уровне транскрипции.
Количество белка Sup35pв штамме [ISP+] выше, чем в штамме [isp-]; количество белка Sup45 в штамме98+[ISP ] снижено. При этом в штамме sfp1Δ наблюдалось наименьшее количествообоих белков. Таким образом, снижение эффективности нонсенс-супрессии,наблюдаемое у штамма [ISP+], по всей видимости, связано с увеличениемколичества белка Sup35.Обращает на себя внимание тот факт, что компенсация дефектатерминации трансляции, обусловленного мутацией sup35-25, происходит приувеличении количества белка Sup35p, кодируемого мутантной аллелью. Мыподтвердили возможность такой компенсации путем экспрессии аллели sup3525смультикопийнойплазмиды,показавповышениеэффективноститерминации трансляции, что на фенотипическом уровне привело к ослаблениюнонсенс-супрессии.Очевидно, что наблюдаемый эффект Sup35 должен быть специфичным изависеть от природы нарушения белка или от уровня его продукции.
Известно,что для нормального осуществления процесса терминации трансляциинеобходимо взаимодействие белков Sup35 и Sup45 (Stansfield et al., 1995;Paushkin et al., 1997; Parsons et al., 2004; Fan-Minogue et al., 2008). При этоммутации, снижающие сродство Sup35 к Sup45, могут быть компенсированыувеличенным количеством белка Sup35, которое увеличивает возможностьвзаимодействия двух белков. Таким образом, если мутация sup35 влияет навзаимодействие с Sup45p, нарушая связывание его с рибосомой илираспознавание стоп-кодона, то увеличенное количество белка Sup35 должноснижать этот дефект.
Возможно, в используемой системе мы имеем делоименно с таким случаем.Важно отметить, что антисупрессорный эффект, наблюдаемый в штамме[ISP+], является аллель-специфичным, поскольку детектируется в отношениидвух мутаций: sup35-10 и sup35-25. Эти мутации расположены вблизи друг отдруга (аминокислотные позиции 363 и 378) и, вероятно, затрагивают одинфункциональный домен белка Sup35, в противоположность мутациям в99позициях 413 и 575 (sup35-112 и sup35-110), нечувствительным к [ISP+] (Volkovet al., 2002). Интересно отметить, что используемая мутация sup35-228 вэксперименте со сверхэкспрессией SFP1, локализована между мутациямиsup35-10 и sup35-25.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
