Диссертация (1145766), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Тем не менее, вывод об усиленной экспрессии гена SUP35 вклетках штамма [ISP+] был подтвержден на следующем этапе.Рисунок 19. Количество мРНК гена SUP35 увеличивается при сверхэкспрессиигена SFP1. В качестве референсного гена использован ген ACT1.82Чтобы проверить, сопровождается ли повышенная экспрессия гена SFP1увеличением количества белка Sup35, мы провели вестерн-блот анализ лизатовтрансформантов штамма 21-Д863, несущих плазмидуpRS426-SFP1, иконтрольных трансформантов.
Как видно из рисунка 20, повышение экспрессиигена SFP1 приводит к увеличению количества Sup35p.Рисунок 20. Количество Sup35p увеличено при сверхэкспрессии SFP1 вштамме 21-Д863, несущем аллель SUP35 дикого типа. Использоваласьмультикопийная плазмида pRS426-SFP1 (↑SFP1 ) и pRS426 (Ø) (для контроля).Цифрами представлено отношение интегральной оптической плотности полосна пленке, характеризующей штамм со сверхэкспрессией SFP1 к контролю.Таким образом, сверхэкспрессия гена SFP1 повышает количество белкаSup35, а на фенотипическом уровне снижает эффективность супрессии,обусловленной мутациями sup35.
Из этого следует, что одна из функций генаSFP1 состоит в контроле эффективности терминации трансляции.833.3.4. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на проявление мутаций sup45Поскольку основную роль в обеспечении терминации трансляции удрожжейобеспечиваютбелкиSup35иSup45,интереснобылопроанализировать влияние сверхэкспрессии SFP1 на проявление мутаций в генеSUP45, кодирующем второй фактор терминации трансляции, Sup45 (eRF1), атакже на уровень экспрессии этого гена.Для этого анализа был использован штамм 1А-Д1628, несущий нонсенсмутации аde1-14 и trp1-289.
Ген SUP45 у этого штамма инактивирован вставкойгена HIS3, а компенсация эффекта дизрупции обеспечивается центромернойплазмидой pRS316, несущей аллель SUP45 дикого типа. Ген SUP35 у этогоштамма представлен аллелью дикого типа, что мы подтвердили с помощьюсеквенирования. Этот штамм трансформировали серией плазмид pRS315,несущих мутантные аллели sup45. Среди этих аллелей было пять аллелей снонсенс-мутациями (sup45-101, -102, -104, -105, -107) и две аллели с миссенсмутациями (sup45-103 и -116). Локализация и характеристика мутацийприведены в таблице 3 (см.
главу «Материалы и методы») и на рисунке 21.sup45-102Tyr53стоп (UAA)sup45-103Lys21Sersup45-101Glu266стоп(UAA)sup45-116Arg62ThrNsup45-107Leu317стоп(UGA)sup45-104Leu283стоп(UAA)Msup45-105Glu385стоп(UAA)CРисунок 21. Локализация мутаций в гене SUP45, использованных в работе.Символами «N», «M» и «С» обозначены участки гена, кодирующиесоответствующие домены белка Sup45.84Трансформантов отбирали на среде SC, не содержащей лейцин. Далеекомпенсирующую плазмиду pRS316-SUP45 элиминировали на среде 5FOA-SCLeu, после чего подтверждали потерю плазмиды с помощью отпечатков насреду, не содержащую урацил.
Последующий анализ фенотипа отобранныхклонов показал, что все мутации sup45, проклонированные в составе плазмидыpRS315, проявляют супрессорный эффект по отношению к нонсенс-мутациямаde1-14 и trp1-289 (рисунок 22). При этом эффективность супрессии одних итех же нонсенс-мутаций у трансформантов, несущих разные мутации sup45,различна, что говорит об отличиях в аллельной специфичности мутаций sup45.Например, в штамме с мутацией sup45-103 с одинаковой эффективностьюсупрессируются нонсенс-мутации аde1-14 и trp1-289, в то время как в штамме смутацией sup45-116 мутация аde1-14 супрессируется более эффективно, чеммутация trp1-289.Рисунок 22.
В присутствии плазмид, несущих мутантные аллели гена SUP45,наблюдается подавление проявления мутаций ade1-14 и trp1-289. Контрольныйштамм, несущий плазмиду с геном SUP45 дикого типа, обозначен как «д.т.»;штаммы, несущие плазмиды с мутантными аллелями sup45-101, sup45-102,sup45-103,sup45-104,sup45-105,sup45-107,sup45-116обозначенывсоответствии с номерами аллелей.После проверки фенотипа трансформантов их использовали дляследующегораундатрансформации,вкоторомвкачествевекторов85использовали мультикопийные плазмиды pRS426-SFP1 и pRS426 (контроль).Селекцию трансформантов проводили на среде SC-Ura.
Для дальнейшегофенотипического анализа отбирали не менее 40 трансформантов каждогоштамма.Анализ фенотипа трансформантов показал, что повышенная экспрессиягена SFP1 по-разному влияет на проявление мутаций sup45. В случае штаммов,несущих нонсенс-мутации sup45, отмечалось ослабление эффективностинонсенс-супрессии практически во всех комбинациях мутаций sup45 исупрессируемых мутаций. В случае штаммов, несущих миссенс-мутации sup45,наблюдался разный эффект по отношению к мутациям ade1-14 и trp1-289. Еслиэффективность супрессии мутации trp1-289 снижалась, то эффективностьсупрессии мутации ade1-14 усиливалась. На рисунке 23 представлен росттипичных трансформантов, полученных в каждой комбинации штаммовреципиентов и плазмид, несущих разные аллели SUP45.Следует отметить, что штаммы, несущие плазмиду pRS426-SFP1,практически во всех случаях демонстрировали более слабый рост на полнойсреде по сравнению с контролем.
Таким образом, как и в случае мутантовsup35, регистрируемый на селективных средах фенотип является отражениемдвух эффектов: снижения жизнеспособности и изменения эффективностинонсенс-супрессии.86Рисунок 23. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к разным фенотипическимэффектам на фоне различных аллелей SUP45. Представлены результатыфенотипического анализа штаммов, несущих: (А) SUP45 дикого типа; (Б)нонсенс-мутантные аллели sup45; (В) миссенс-мутантные аллели sup45.Как и в случае мутаций sup35 (см.
раздел 3.3.2. главы «Результаты»),необходимо было выяснить, обусловлено ли изменение фенотипа клонов,трансформированныхплазмидой,содержащейSFP1,эффектомсверхэкспрессии этого гена, или оно является следствием прионизации Sfp1.Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы элиминировали плазмиду pRS426SFP1, пассируя клетки на полной среде YEPD. По отсутствию роста87отобранных клонов на среде, не содержащей урацил, убеждались в отсутствии вклетках плазмиды pRS426-SFP1. В случае штамма, несущего sup45-116,использовали среду, содержащую 5-FOA, поскольку все клоны такого генотипапосле пассирования на среде YEPD сохраняли плазмиду pRS426-SFP1.После потери плазмиды, несущей SFP1, у всех клонов восстанавливалсяпервоначальный супрессорный фенотип, то есть фенотип опытных клоновсовпадал с фенотипом контрольных клонов, трансформированных pRS426(рисунок 24).
Таким образом, мы можем сделать вывод, что наблюдаемая притрансформациимультикопийнойплазмидойpRS426-SFP1антисупрессияобусловлена повышением количества белка Sfp1 и не связана с возникновениемприона [ISP+].Рисунок 24. После потери мультикопийной плазмиды pRS426-SFP1 Sup+фенотип штаммов, несущих как нонсенс- (А), так и миссенс- (Б) мутацииsup45, восстанавливается.88Таким образом, сверхэкспрессия SFP1 подавляет проявление не толькомутаций sup35, но и некоторых мутаций sup45.3.3.5. Влияние сверхэкспрессии гена SFP1 на экспрессию аллели дикоготипа и мутантных аллелей гена SUP45На следующем этапе работы мы провели оценку влияния повышеннойэкспрессии гена SFP1 на уровень белка Sup45 в производных штамма 1АД1628, несущих аллель SUP45 дикого типа, а также мутантные аллели sup45104 (несет стоп-кодон UAA) и sup45-116 (несет миссенс-мутацию).
Вестернблот анализ показал, что сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количество белкаSup45 в штаммах, несущих аллель дикого типа SUP45 и миссенс-мутациюsup45-116. В штамме с нонсенс-мутацией sup45-104 сверхэкспрессия SFP1приводит к увеличению количества фрагмента белка Sup45, образующегося притерминации трансляции на стоп-кодоне, возникшем вследствие мутации.Количество полноразмерного Sup45p в этом штамме такое же, как в контроле(рисунок 25). Увеличение количества фрагмента Sup45p, синтезируемого подконтролем аллели sup45-104, говорит о повышении эффективности терминациитрансляции при сверхэкспрессии SFP1. Об этом же свидетельствует снижениеэффективностисупрессии,зарегистрированноесверхэкспрессии SFP1 (см.
рисунок 23).уэтогомутантапри89Рисунок 25. Сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количество Sup45p,синтезируемого под контролем аллели дикого типа (обозначено как «д.т.») иаллели с миссенс-мутацией sup45-116 (обозначено как «116»), но увеличиваетколичество фрагмента Sup45р у штамма с нонсенс-мутацией sup45-104(обозначено как «104»). Использовалась мультикопийная плазмида pRS426SFP1и pRS426 (для контроля).
Знаком «*» отмечена зона неспецифическойгибридизации с антителами.Поскольку количество полноразмерного белка Sup45 в этом штамме неувеличено, логично предположить, что наблюдаемые эффекты обусловленыповышением уровня Sup35p. Проверка этого предположения показала, что присверхэкспрессии SFP1 количество Sup35p во всех трех проанализированныхштаммах действительно увеличено (рисунок 26).90Рисунок 26. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к увеличению количества белкаSup35 в штаммах, несущих различные аллели гена SUP45. Использовалимультикопийные плазмиды pRS426-SFP1 и pRS426 (в качестве контроля).Таким образом, сверхэкспрессия SFP1 не изменяет количество белкаSup45, а ее влияние на проявление мутаций sup45 обусловлено изменениемколичества белка Sup35.3.4.
Определение последовательности гена SFP1 в штамме 25-25-2В-П3982и в плазмиде pRS426-SFP1Известно, что штаммы Петергофских Генетических Линий отличаются понуклеотидной последовательности некоторых генов от референсного штаммаS288C, представленного в SGD (Saccharomyces Genome Database, www.yeastgenome.org) (Волков и др., 2000; Moskalenko et al., 2003).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
