Диссертация (1145766), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Этот препарат фотографировали спомощью микроскопа с фотонасадкой. Измерение площади клеток путемобработкиполученныхизображенийописано«Биоинформационные и статистические методы».вразделе2.6.59Выделение тотальной РНК из клеток дрожжей и полимеразная цепная реакцияв режиме реального времениАнализируемые штаммы со штриха с твердой среды засевали в 50 млжидкой среды YEPD или среды SC без добавления лейцина (в случае штаммов25-25-2В-П3982 и 1Б-Д1606, трансформированных плазмидами RS425 иpRSU3-25), или среды SC без добавления урацила (в случае штаммов 21-Д863 и1А-Д1628, трансформированных плазмидами pRS426 и pRS426-SFP1).
Клеткивыращивали до достижения оптической плотности 0.5-0.7, что приблизительносоответствует началу логарифмической фазы роста культуры. После этогоклетки осаждали центрифугированием в 50-мл пробирках (5000 об/мин, 5минут), дважды отмывали от среды стерильной дистиллированной водой,осадок переносили в пробирки типа «эппендорф», центрифугировали (5000об/мин, 2 минуты) и замораживали.Далее клетки размораживали и добавляли 100 мкл PureZol (Bio-Rad) и 200мкл стеклянных шариков (Sigma); содержимое пробирки перемешивали спомощью вортекса.
Затем в пробирку добавляли 900 мкл PureZol; содержимоеперемешивали и центрифугировали (13200 об/мин, 10 минут). Затем добавляли200 мкл хлороформа (Нева-Реактив) и перемешивали содержимое пробиркипереворачиванием, после чего центрифугировали (13200 об/мин, 10 минут),отбирали верхнюю прозрачную фракцию в новую пробирку и осаждалидобавлением 1 мл 96% этилового спирта (Merck) при температуре -20 °C втечение получаса и последующим центрифугированием (13200 об/мин, 10минут). Образующийся осадок промывали 70% этиловым спиртом (Merck) ицентрифугировали (13200 об/мин, 1 минута), затем высушивали, после чегорастворяли в воде, очищенной от РНКаз (Ambion).
На следующем этапе растворочищали от ДНК с помощью набора реактивов RapidOut DNA Removal Kit(ThermoScientific), содержащего ДНКазу, согласно инструкции. КонцентрациюРНК определяли с помощью NanoDrop.Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора60реактивов RevertAid Reverse Transcriptase (ThermoScientific) по протоколупроизводителя; для этой реакции брали 500 нг тотальной РНК.Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали 2,5хнабор реагентов EVA Green (Синтол), согласно рекомендациям производителя.Для проведения реакции и считывания флуоресценции использовали ПЦРамплификатор СFX96 (Bio-Rad). В экспериментах использовали не менее трехповторностей выделения для каждого штамма; реакцию с каждой порциейнезависимо полученной кДНК проводили в трёх технических повторностях какдля генов интереса (SUP35 и SUP45), так и для контрольного гена (ADH1).Праймеры к последовательности SUP35 и SUP45 подобраны Е.
А. Андреевой,праймеры к последовательности ADH1 были взяты из статьи CankorurCetinkaya et al., 2012. Праймеры были синтезированы в компании «Бигль», ихпоследовательности приведены в таблице 4. По кривым флуоресценцииопределяли пороговый цикл для каждой реакции (Cq), вычисляли среднее потехническимповторностям,послечеговычислялинормализованноесоотношение экспрессии гена интереса в опытных и контрольных штаммах пометоду Ливак (Livak and Schmittgen, 2001). Разницу полученных значенийвычисляли с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.Таблица 4.
Праймеры для проведения ПЦРРВ, использованные в работе.НазваниепраймераF-ADH1-RTR-ADH1-RTSUP35_FSUP35_RSUP45_FSUP45_RACT1-FACT1-RПоследовательность 5’→3’АмплифицируемыйCAAGTCGTCAAGTCCATCTCGTAGACAAGCCGACAACCTACAACAAGGTAACAACAGATACCGGATTGAATTGCTGCTGATAACCGATCCAAGACTAGCATGTAAGCTTGAACATACTTGACATTGGCгенADH1ADH1SUP35SUP35SUP45SUP45ACT1TCGAACAAGAAATGCAAACCGCTGCTGACTTGACCATCTGGAAGTTCGTAGG ACT161Методы работы с белкамиВыращивание культур дрожжей в жидкой среде для последующеговыделения белков производили аналогично описанному выше до достиженияоптической плотности OD600=1,5, что соответствует началу стационарнойфазы роста. Клетки осаждали и замораживали при -70 °С.
Далее для полученияклеточных экстрактов пробирки с клетками размораживали, добавляли к ним100 мкл охлажденного до +4°С лизирующего буфера, содержащего TBS (25 мMTris-HCl (pH 7.4), 100 мM NaCl), 2mM ингибитор протеаз - фторидфенилметилсульфонил (PMSF) (Sigma), тритон и коктейль ингибиторов протеаз(Sigma).
К суспензии клеток добавляли 200 мкл стеклянных шариков (Sigma) иразрушали клетки, встряхивая пробирки на шейкере на максимальной скорости(8 раз по 30 секунд, после каждого раза пробирки инкубировали во льду 30секунд). Далее пробирки с лизатами клеток центрифугировали при +4°С втечении 2 минут при 5000 об/мин. Супернатант аккуратно переносили в новыепробирки, после чего выравнивали общее количество белка с использованиемметода М.Брэдфорд (Bradford, 1976). Каждую пробу расфасовывали по 15 мкл,к которым добавляли по 5 мкл буфера для нанесения проб, инкубировали втермоблоке при 100°С в течение 5 минут и затем переносили в лед.ЭлектрофорезденатурированныхбелковвсодержащемSDSполиакриламидном геле (SDS-PAGE) проводили в соответствии со стандартнойметодикой (Sambrook et al., 1989).
Были использованы концентрирующий иразделяющий гели с 5% и 10% содержанием акриламида соответственно. Послепроведения электрофореза белки переносили на поливинилидендифторидную(PVDF) мембрану Hybond-P (Amersham) при силе тока 1 мА на 1см 2 мембраныс использованием аппарата для сухого переноса Transblot Semi-Dry Transfer Cellфирмы Bio-Rad в соответствии с инструкциями производителя (Towbin et al.,1979).Инкубацию PVDF-мембран с первичными поликлональными антителами62SE90 и SE45-2, специфичными к Sup35 или Sup45 соответственно, проводили вбуфере TTBS (0,8% NaCl, 0,02М Трис-HCl, 0,1% Tween-20, pH 7,6),содержащем 2% обезжиренного сухого молока (Valio).
Антитела SE90 былилюбезно предоставлены С.В. Шабельской, SE45-2 – С.Е. Москаленко. Вкачестве вторичных антител были использованы антитела, входящие в наборECL Plus Western Blotting Reagent Pack (Amersham, Швеция). Детекцию белковпроизводили при помощи набора реагентов ECL Plus Western Blotting DetectionSystem (Amersham, Швеция). Полученные с помощью прибора GeneGnome(Syngene) изображения сканировали и обрабатывали в программе ImageJ 1.44p(http://rsbweb.nih.gov/ij/).Выравненность концентраций белков оценивали с помощью окрашиваниямембраны в растворе Кумасси согласно протоколу (Welinder and Ekblad, 2011)со следующим изменением: вместо Coomassie R-350 использовали CoomassieR-250.СеквенированиеСеквенирование аллели SUP35 в штамме 1А-Д1628 проводили сиспользованием праймеров 97, 98, 102, 103, 112, 113, 117, 161 и 163, описанныхС.В.
Шабельской с соавторами (Chabelskaya et al., 2004) (таблица 5). Дляамплификации аллели SUP35 использовали праймеры 97 и 98.Секвенирование аллели SUP45 в штамме 21-Д863 проводили сиспользованием праймеров 82, 83, 87, 92, 93, 94, 100, 104 и 105 (см. таблицу 5),описанных Москаленко с соавторами (Moskalenko et al., 2003; Москаленко идр., 2004).
Для амплификации аллели SUP45 использовали праймеры 82 и 83.Секвенирование аллелей обоих генов проводили в фирме "АТГ Сервисген" (www.service-gene.spb.ru).Определение последовательности гена SUP45 в двух клонах штамма 21Д863 после сверхэкспрессии SFP1 и последующей потери плазмиды pRS426-63SFP1,осуществлялинакоммерческойосновевкомпании«Бигль»(http://www.biobeagle.com/) на секвенаторе MegaBACE 1000 DNA AnalysisSystem с использованием праймеров 82, 83, 87, 93, 100, 105.
Праймеры,использованные для амплификации и секвенирования фрагмента, приведены втаблице 5.Определение последовательности гена SFP1 в штамме 25-25-2В-П3982осуществлялинакоммерческойосновевфирме"АТГСервис-ген"(www.service-gene.spb.ru). Секвенирование аллели гена SFP1 в плазмидеpRS426-SFP1 было проведено А.Э. Машарским на базе ресурсного центраСПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Праймеры,использованные для секвенирования SFP1, представлены в таблице 5.2.6. Биоинформационные и статистические методыПодбор праймеров и анализ последовательности плазмид осуществляли спомощью программного пакета Vector NTI 9.0.0 (Infomax).
Анализ данных посеквенированиюпроводиливпрограммеBioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). Последовательности геномнойДНК генов SUP35, SUP45 и SFP1 были получены из электронной базы данныхSGD (Saccharomyces Genome Database) (www.yeastgenome.org). Обсчет полос наизображении, полученном с помощью прибора GeneGnome (Syngene), длясравнительного анализа количества белка в пробах проводили с помощьюпрограммного пакета ImageJ 1.44p (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
В этой программетакже обрабатывали фотографии микропрепаратов клеток для исследованияразмеров клеток (см. раздел 3.3.1.), калибруя единицы длины по размеруквадратов камеры. Объём выборки составлял 100 клеток с каждого препарата.64Таблица5.Последовательностипраймеров,использованныхдлясеквенирования последовательности генов SUP35, SUP45 и SFP1.НазваниеПоследовательность (5'→3')Секвенируемыйген82CATTTCGGCTTGTCTCCSUP4583TCTGGCATCTAGTGATTAAATTCSUP4587CCTCATTATCCTCGGCATCSUP4592GTTCGATGTCAAAAGTGACSUP4593GACGAAATTTCCCAGGACACSUP4594CAAAAACTTCGGTGCTACSUP45100GACATCGAACCTTACAAACCTATCSUP45104GAAAGGTCGCCGAAGTTGCTGSUP45105CAGCAACTTCGGCGACCTTTCSUP4597CTTCTCTTGAAAGACTCCATTGTACSUP3598GAAAATGCTTTATGATCGGTATTATTGSUP35102CGGTTTCTTCATCGACTTGCTCSUP35103GATCGGTATTATTGTGTTTGSUP35112CTTGCTCACCACACATAGCCATATCAACSUP35113GGAGGAGAAACCAGTCCAGACTGAAGSUP35117CTATCATAGCAGCCGGTTTTTCATGSUP35161CTTTACCACCAAACATATCGTTAACSUP35163GTAAGCTTGATAACCTTGGTATCTGSUP35sfp1_f1TTTGATTCTGATGTCCGTSFP1sfp1_f2GTATGTGGACGATTCACCATSFP1sfp1_f3ATTGCTGCTATGAGCCTGSFP1sfp1_f4GGCTATTGATTCTCTCCGTASFP1sfp1_r1GGCAAGCAATATGGCTACSFP1sfp1_r2CACTGCTTATCTGCCAAATCSFP1sfp1_r3CCAACTCGGGCTTATCTATGSFP1sfp1_r4ACGATGACGATGACACAGASFP1sfp1_F2CATTCTAGTGGCTCCGTTASFP1sfp1-endGTGAGTGGAGTGGCCCCTGTSFP165Всю статистическую обработку результатов производили с помощьюпрограмм RConsole (R Development Core Team, 2012; www.r-project.org) иOpenOffice.org Calc.
Для попарных сравнений применяли критерий ВилкоксонаМанна-Уитни (Sokal and Rohlf, 1995; Шипунов и др., 2012).66ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1. Влияние детерминанта [ISP+] на экспрессию генов SUP35 и SUP45Прион[ISP+]наследственныйбылизначальнодетерминант,обнаруженприводящийккакснижениюнехромосомныйэффективностисчитывания стоп-кодонов в присутствии некоторых нонсенс-супрессорныхмутаций в гене SUP35 и криптических мутаций в гене SUP45, что нафенотипическом уровне проявляется как антисупрессия (Volkov et al., 2002;Аксенова и др., 2006).
Позже в качестве структурного гена детерминанта [ISP+]был идентифицирован ген SFP1 (Rogoza et al., 2010). Как упоминалось в Обзорелитературы, продуктом гена SFP1 является транскрипционный фактор,активирующий экспрессию многих генов дрожжей, в том числе и генов,кодирующих компоненты аппарата трансляции (Xu and Norris, 1998; Jorgensenet al., 2002; Fingerman et al., 2003; Jorgensen et al., 2004; Cipollina et al., 2008a;Cipollina et al., 2008b). Однако прямые данные, связывающие изменениеэффективности терминации трансляции с функцией белка Sfp1p в егонормальной и прионной форме, пока отсутствуют.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
