Диссертация (1145766), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Однако,гомологичная область C-домена белка eEF1A не способна компенсироватьлетальныйэффектделецииC-доменаSup35,чтосвидетельствуетофункциональном различии этих белков (Ter-Avanesyan et al., 1993).C-домен Sup35 содержит 4 сайта связывания с фактором Sup45 и участоксвязывания с ГТФ; именно в этом домене локализуются нонсенс-супрессорныемутации (Paushkin et al., 1997; Ter-Avanesyan et al., 1993; Zhouravleva et al.,1995).M-домен (124-253 а.к.) содержит большое количество заряженныхаминокислот.
M-домен, в отличие от C-домена не является жизненнонеобходимым и его функция до сих пор недостаточно ясна, однако естьпредположения, что M-домен важен для поддержания приона [PSI+] и крометого, являясь «спейсерным» участком, соединяющим C- и N-домены, придаетмолекуле Sup35 стабильность (Liu et al., 2002; Bradley and Liebman, 2004; TerAvanesyan et al., 1993).N-домен (1-123 а.к.) не является жизненно-важным, однако в немлокализованы сайты связывания с различными белками. Для этого районапродемонстрировано взаимодействие его с поли(А)-связывающим белком PABP(Cosson et al., 2002; Hoshino et al., 1999) и предполагается наличие в нем30второго сайта связывания с белком eRF1 (Paushkin et al., 1997). Кроме того, удрожжей глутамин- и аспарагин-богатый N-домен Sup35р ответственен заприонизацию этого белка и поддержание приона [PSI+], в результате чего Nдомен Sup35 получил название «прионный домен» PrD (от «Prion Domain»)(Ter-Avanesyan et al., 1993; Paushkin et al., 1996; Wickner et al., 1999).В N-домене белка Sup35 выделяют собственно аспарагин/глутаминбогатый участок (Q/N) и следующий за ним участок, содержащий 5 полных иодну частичную копию олигопептидного консенсуса PQGGYQQ-YN, которыйнеобходим для стабильного наследования прионных агрегатов, опосредуя ихфрагментацию шапероном Hsp104 (Osherovich et al., 2004).У дрожжей мутации в генах SUP35 и SUP45 рецессивны и приводят ксупрессии всех трех стоп-кодонов (Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970), так какчастичная инактивация белков Sup35 или Sup45 ослабляет конкуренциюфакторов терминации за стоп-кодоны, позволяя эндогенным тРНК считывать ихкак значащие.
Помимо этого, мутации в генах SUP35 и SUP45 обладают рядомплейотропных эффектов, таких как полная или частичная неспособность кдыханию,чувствительностькаминогликозиднымантибиотикамиповышенному осмотическому давлению, а также летальность при повышеннойили пониженной температуре (Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970; Андриановаи др., 1973; Ter-Avanesyan et al., 1982; Миронова и Тер-Аванесян, 1983).1.5.5. Роль системы NMD в контроле нонсенс-супрессииНакопление в клетке большого количества аберрантных белковыхпродуктов может привести к снижению жизнеспособности клетки.
Поэтомусуществует механизм распознавания и деградации мРНК, кодирующих такиебелки. Сигналом для идентификации такого рода мРНК могут служитьотсутствие или укорочение поли(А)-последовательности на 3’- конце мРНК,отсутствие 7-метилгуанозинового «кэпа», а также присутствие интронов,31преждевременных стоп-кодонов в рамке считывания или инициаторныхкодонов вне открытой рамки считывания (см.
Baker and Parker, 2004; см. Collerand Parker, 2004).Существует несколько систем, действующих на уровне мРНК ипредназначенных для защиты клетки от возможного накопления аберрантныхмРНК или нефункциональных белков (см. Kervestin and Jacobson, 2012).Система деградации мРНК REMD (Ribosome Extension-Mediated Decay)распознает мРНК, не содержащие естественный стоп-кодон в конце открытойрамки считывания. В таком случае рибосома продолжает синтез за пределы 3'нетранслируемой области (Kong and Liebhaber, 2007).Система деградации мРНК, утративших стоп-кодон в результатеполиаденилированиявпределахкодирующейпоследовательностиприпреждевременном прерывании транскрипции, получила название NSD (NonStop-Decay) (см.
Isken and Maquat, 2007).В некоторых случаях в мРНК могут возникать шпильки, приводящие кблоку элонгации трансляции. У дрожжей изучен механизм деградации такихмРНК, получивший название NGD (No-Go Decay). Интересной особенностьюэтого механизма оказалось то, что в отличие от других систем, в которыхпринимаютучастиеэкзонуклеазы,вслучаеNGDпроисходитэндонуклеолитическое расщепление мРНК вблизи остановки рибосомы (см.Isken and Maquat, 2007).Система деградации мРНК, содержащих стоп-кодоны в открытой рамкесчитывания, получила название системы деградации нонсенс-содержащихмРНК — NMD (Nonsensе-Mediated mRNA Decay) (cм. Gonzalez et al., 2001; см.Kervestin and Jacobson, 2012). Такие транскрипты могут возникать по разнымпричинам.
Так, при нарушениях сплайсинга в транскриптах могут сохранятьсяинтроны или участки интронов со стоп-кодоном. В других случаях деградацииподвергаются транскрипты, содержащие нонсенс-мутации или мутации,приводящие к сдвигу рамки считывания, а также транскрипты, содержащиеоткрытые рамки считывания в 5' нетранслируемой области.
Основными32факторами, участвующими в NMD, являются белки Upf. Мутации в генах UPFили снижение экспрессии этих генов приводят к стабилизации мРНК,содержащихпреждевременныйстоп-кодон,увеличиваятемсамымихколичество в клетке, но при этом практически не влияют на нормальныетранскрипты.Цитоплазматический белок Upf1 представляет собой РНК-зависимуюАТФазу и АТФ-зависимую 5’-3’-геликазу и является главным фактором,вовлеченным в NMD. Факторы Upf2p и Upf3p выполняют вспомогательнуюроль, регулируя работу Upf1p. Когда рибосома в процессе элонгациитрансляции доходит до преждевременного стоп-кодона, PTC (от prematuretermination codon), Upf1p взаимодействует с факторами eRF1 и eRF3 длязавершениятерминациитрансляции.Существуетнесколькогипотез,объясняющих механизм NMD. В одной модели важную роль предписываютспециальным белкам, которые располагаются с 3'-конца от стоп-кодона иявляются «маркерами» для деградации таких мРНК (см. Shyu et al., 2008).Предполагается, что с этими маркерными белками взаимодействует белок Hrp1,который в свою очередь взаимодействует с Upf1p.
Это взаимодействие являетсясигналом для присоединения белков Upf2 и Upf3 и индуцирует декэпированиемРНК, которое является первым этапом в ее деградации. При этом в случаенормальных транскриптов в первом раунде трансляции рибосома удаляетмаркерные белки, предотвращая таким образом деградацию мРНК. Эта модельне является универсальной и оставляет много вопросов и возражений. По всейвидимости, большинство транскриптов подвергаются NMD без участиямаркерных белков.Другая модель NMD основывается на исследовании 3'-нетранслируемойобласти (3'-UTR) у стоп-кодона в молекуле мРНК (см. Shyu et al., 2008).Исследованиянадрожжахпоказали,чтоделециякодирующейпоследовательности «вниз по течению» от PTC приводит к сближениюестественной 3'-UTR области с PTC, что стабилизирует транскрипт.
При этоммРНК с искусственным удлинением 3'-UTR области является мишенью33системы NMD (см. Kervestin and Jacobson, 2012). Таким образом, длянормальной терминации трансляции необходима определенная длина 3'-UTRобласти вниз по течению от стоп-кодона, следовательно, эта областьдействительно является важным элементом при работе системы NMD.
В этоймодели важную роль отводят также взаимодействию фактора терминациитрансляции eRF3 и поли-(А)-связывающего белка PABPC1 (Pab1 у дрожжей)(рисунок 3). Хотя, делеция Pab1 или его домена, ответственного завзаимодействие с eRF3, не приводит к тому, что нормальные транскриптыподвергаются деградации.Вторая модель также до сих пор не является подтвержденной. Вчастности, неясно, почему Upf1 связывается с 3'-UTR при ингибированиитрансляции, хотя NMD зависит от распознавания стоп-кодона рибосомой.Также показано, что Upf1 человека способен распознавать даже различные подлине 3'-UTR области дрожжей (по Kervestin and Jacobson, 2012).
Несмотря нато, что за последние годы исследование системы NMD позволило выяснитьмного фактов, тем не менее, точный механизм деградации мРНК, содержащихпреждевременный стоп-кодон, остается неясным.У Caenorhabditis elegans и других многоклеточных организмов вработу системы NMD вовлечены и другие факторы, например, SMG-белки,вовлеченные в цикл фосфорилирования/дефосфорилирования Upf1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
