Диссертация (1145748), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Так, краткосрочное увеличениеколичества HIF1a в СА1 поле гиппокампа крыс, переживших ТГ, сопровождаетсяувеличением активности Г6ФДГ. Однако параллельно в этой структуре мозга наблюдаетсястабильное уменьшение количества НАДФН, что может быть результатом HIF1-зависимойстимуляции гликолиза как на уровне транскрипции, так и за счет гипоксия-опосредованнойстимуляции активности PFKFB-3 (Semenza, 2001, Fernandez-Fernandez et al., 2012). В то жевремя ПостК, способствующее стабилизации с последующей up-регуляцией уровня HIF1a84в СА1 поле гиппокампа, также вызывает постепенную нормализацию количества иактивности Г6ФДГ и нормализует интенсивность процессов восстановления НАДФН.Кроме того, нами в очередной раз подтвержден факт того, что сенсомоторная кора являетсяболее резистентной к гипоксии структурой мозга, чем гиппокамп.
Согласно результатамнастоящей работы, снижение экспрессии HIF1a во втором слое неокортекса крыс,переживших ТГ, наблюдается только в течение первого дня после реоксигенации, а вдальнейшем уровень HIF1a в этой структуре нормализуется, так же, как и нормализуетсясодержание и активность Г6ФДГ и количество НАДФН, что согласуется с менеевыраженным по сравнению с гиппокампом накоплением TUNEL-позитивных клеток и,вероятно, способствует предотвращению окислительного стресса.
В свою очередь ПостКспособствует небольшому ускорению восстановления исследуемых параметров доконтрольных значений (активность Г6ФДГ, количество НАДФН).Полученные нами данные указывают на корреляцию между HIF1 и ПФП. Однакотакже выявлена прямая зависимость между содержанием HIF1a и интенсивностьюапоптических процессов в структурах мозга крыс, переживших ТГ. При этом установленововлечение нормализации активности ПФП в реализацию эффектов ПостК. В связи с этимна данном этапе работы возникло предположение о HIF1-независимой прямой регуляцииПФП гипоксией и реоксигенацией – изучению этого вопроса посвящены следующиеразделы настоящей работы.4.01.05.
Анализ окислительно-восстановительного статуса и количества общегоглутатионаСогласно нашей гипотезе дефицит активности ПФП в гиппокампе (но не внеокортексе) крыс, переживших ТГ, должен приводить к долгосрочному смещениюокислительно-восстановительного статуса клеток в сторону окисленного состояния испособствовать уменьшению количества свободного глутатиона, а нормализация егоактивности вследствие ПостК - к нормализации этих параметров.Для оценки наличия окислительного стресса нами был измерен окислительновосстановительный статус цитозольной фракции гиппокампа и неокортекса крыс посоотношению тиоловых групп к общему содержанию белка.
Как видно из Рисунка 20, А,дефицит эффективности пентозофосфатного пути в гиппокампе крыс, переживших ТГ,действительносопровождаетсядолгосрочнымсмещениемокислительно-85восстановительного статуса клеток в сторону окисленного состояния. Так через 1, 2 и 4 дняпосле ТГ данный показатель составляет 75%, 42% и 57% от контроля, соответственно.Устойчивое уменьшение количества глутатиона в гиппокампе (14%, 15% и 11% отконтроля через 1, 2 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 20, Б) также подтверждаетразвитие состояния окислительного стресса в этой структуре мозга крыс в результате ТГ ипоследующей реоксигенации.ПостК нормализует количество тиоловых групп в гиппокампе (89% и 103% отконтроля через 2 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 20, А), вызывая существенное,хоть и не достигающее контрольных значений, увеличение количества глутатиона через 4дня после ТГ (74% от контроля) (Рисунок 20, Б).Рисунок 20.
Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сгипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на количество тиоловых групп (А,В)и количество глутатиона (Б,Г) в гиппокампе (А,Б) и неокортексе (В,Г) крыс. Количествотиоловых групп и глутатиона нормализованы на количество общего белка и выражены в %от контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различиядостоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.86Маркеры окислительного стресса в неокортексе крыс, переживших ТГ, выявленытолько через 1 день реоксигенации.
Так количество тиоловых групп и глутатиона на этойвременной точке составляет 71% и 81% от контроля (Рисунок 20, В,Г), соответственно. Вдальнейшем, через 2 и 4 дня после непосткондиционированной ТГ, эти показателидостоверно не отличаются от базального уровня (123% и 87% от контроля для тиоловыхгрупп и 119% и 104% от контроля для глутатиона, через 2 и 4 дня после ТГ, соответственно).ПостК не вызывает достоверного изменения количества тиоловых групп внеокортексе по сравнению с непосткондиционированной ТГ (96% и 83% от контроля через2 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 20, В), однако приводит к небольшомууменьшению количества глутатиона через 4 дня реоксигенации.Таким образом, нами выявлена сходная динамика содержания и активностиключевого фермента ПФП - Г6ФДГ и ПФП-опосредованных процессов, а именноизменения содержания восстаноленного НАДФ, и окислительно-восстановительногостатуса, в гиппокампе и неокортексе крыс, переживших ТГ с последующими сеансамиПостК или без них.
Так отсроченное уменьшение количества и активности Г6ФДГ на фонеуменьшения уровня НАДФН в гиппокампе приводит к формированию состоянияокислительного стресса, выражающегося в смещении редокс статуса клеток в сторонузакисления и уменьшении количества глутатиона в этой структуре мозга и сопровождаетсязапускомапоптотическихпроцессов.ВтожевремяПостК,обладающееаниапоптотическим действием и способствующее нормализации количества и активностиГ6ФДГ, нормализует наработку НАДФН, предотвращает снижение уровня тиоловых групп,способствуя нормализации количества глутатиона. Так как основным фактором патогенезаострых форм гипоксии/ишемии признана интенсификация свободно-радикальногоокисления и последующий окислительный стресс (Maiti et al., 2006, Nita et al., 2001,Sugawara et al., 2003), стимуляция эффективности антиоксидантных систем черезнормализацию активности ПФП, опосредованную ПостК, вероятно представляет собойважный механизм нейропротекции.В то же время в неокортексе крыс, переживших ТГ, где наблюдается быстраянормализация содержания и активности Г6ФДГ, а также стабилизация количества НАДФН,а также не происходит долгосрочных изменений количества тиоловых групп и глутатиона,что согласуется с менее выраженным по сравнению с гиппокампом накоплением TUNELпозитивных клеток и, вероятно, способствует предотвращению окислительного стресса.
Всвою очередь ПостК не влияет ни на количество тиоловых групп, ни на содержание общего87глутатиона в этой структуре мозга, оказывая в итоге менее выраженный по сравнению сгиппокампом противоапоптотический эффект.4.01.06. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидовПри анализе эффектов ТГ на процессы свободнорадикального окисления в раннийпериод реоксигенации, когда забор материала осуществляли сразу после сеанса ТГ,показано, что ТГ оказывает разный эффект на гиппокамп и сенсомоторную кору. Так вгиппокампе наблюдается интенсификация процессов ПОЛ (Рисунок 21): количестводиеновых коньюгатов увеличивается до 130% от контроля, что сопровождаетсяувеличением коэффициента Клейна до 131% и ведет к накоплению Шиффовых оснований,количество которых достигает 170% от базального уровня.
В то же время в неокортекседостоверных изменений процессов ПОЛ не выявлено.Рисунок 21. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) на количество диеновых и триеновыхконьюгатов, коэффициент Клейна и количество основыний Шиффа в гиппокампе крыс.Количество продуктов перекисного окисления липидов нормализованы на количествообщего фосфора фосфолипидов и выражены в % от контроля.
* Различия достоверны поотношению к контролю, p≤0.05.88В дальнейшем в гиппокампе крыс, переживших тяжелую гипоксию, на протяжении4 дней после воздействия не выявлено достоверных отличий количества оснований Шиффапо сравнению с контролем (Рисунок 22, А), но при этом через 1 день после третьего сеансапосткондиционирования этот показатель в гиппокампе крыс составляет всего 30% отконтроля (Рисунок 22, А), что указывает на антиоксидантный эффект ПостК для этойструктуры мозга и согласуется с данными о мобилизации ПФП.Рисунок 22.
Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сгипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на количество оснований Шиффа вгиппокампе (А) и неокортексе (А) крыс. Количество оснований Шиффа нормализовано наколичество общего фосфора фосфолипидов и выражено в % от контроля *, - различия сконтролем статистически достоверны, р≤0.05; #, различия статистически достоверны посравнению с ТГ, р≤0.05При этом в неокортексе крыс в течение 4 дней после ТГ количество основанийШиффа достоверно ниже, чем в контроле (Рисунок 22, Б). Через 3 дней после ТГ, а такжена всех исследуемых сроках ТГ+ПостК достоверных отличий количества основанийШиффа по сравнению с контролем не выявлено.Поскольку в ходе проведенных исследований было установлено существенноеразличие между ответами клеток гиппокампа и неокортекса крыс на гипоксическиевоздействия, указывающее на относительную устойчивость неокортекса к тяжелойгипоксиии,какследствие,наотсутствиеэффектовгипоксическогопосткондиционирования на эту структуру мозга, дальнейшие исследования, посвященныеизучению роли HIF1 в реализации эффектов ТГ, а также оценки взаимосвязи между этимтранскрипционнымфактором,пентозофосфатнымпутемипентозофосфатным путем функциями, были проведены на гиппокампе.опосредованными894.02.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
