Диссертация (1145748), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Использование ингибитора HIF1 способствуетослаблению свободнорадикального окисления в течение 2 дней после ТГ (Рисунок 32).Рисунок 32. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на количество оснований Шиффа в гиппокампе крыс.КоличествооснованийШиффанормализованонаколичествообщегофосфора99фосфолипидов и выражено в % от контроля *, различия с контролем статистическидостоверны, р≤0.05; #, различия статистически достоверны по сравнению с тяжелойгипоксией, р≤0.05Таким образом, отсроченное уменьшение количества и активности Г6ФДГ иснижение уровня НАДФН в результате ТГ сопровождается формированием долгосрочногоокислительного стресса в гиппокампе крыс, что выражается в уменьшении количестватиоловых групп и общего глутатиона и завершается массированной клеточной гибелью.
Вто же время использование ингибитора HIF1 перед ТГ предотвращает краткосрочнуюстимуляцию этого транскрипционного фактора, нормализует работу ПФП, а именноспособствует повышению количества НАДФН и предотвращает окислительный стресс, темсамым ослабляя интенсивность процессов свободнорадикального окисления липидов инивелируя апоптотические процессы.4.03. Использование модели трехкратной умеренной гипобарической гипоксии дляанализа роли HIF1 в регуляции транскрипции мРНК Г6ФДГС использованием метода ПЦР в реальном времени мы провели исследованиевзаимосвязи между активностью HIF1 и транскрипцией Г6ФДГ в гиппокампе.
В качествеHIF1-позитивной модели мы использовали режим трехкратной умеренной гипобарическойгипоксии (3УГГ) (Samoilov et al., 2015) на фоне инъекции ингибитора HIF1 либо без нее.Как видно на Рисунке 33, количество мРНК Г6ФДГ существенно увеличиваетсячерез 3 часа и 24 часа после последнего сеанса УГГ. При этом, ведение ингибитора HIF1непосредственно перед гипоксическими сеансами усиливает этот эффект как через 3 часа,так и через 24 часа после последнего гипоксического эпизода.
В то же время введениеингибитора HIF1 контрольным крысам не оказывает влияния на экспрессию мРНК Г6ФДГпо сравнению с контролем.100Рисунок 33. Влияние трехкратной умеренной гипобарической гипоксии (3УГГ) и 3УГГ всочетании с ингибированием HIF1 (3УГГ+HIF1i) на уровень мРНК Г6ФДГ в гиппокампекрыс через 3 и 24 часа после воздействия. Количество мРНК Г6ФДГ нормализовано наколичество мРНК актина-бета.
*, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05;#, Различия достоверны по отношению к группе 3УГГ, p≤0.05.Таким образом, с использованием HIF1-позитивной модели 3УГГ in vivo, мыпоказали наличие обратной связи между активностью HIF1 и транскрипцией первогоскорость-лимитирующего фермента ПФП, Г6ФДГ, подтвердив ранее полученные намиданные (результаты раздела 4.02) о стимуляции ПФП в гиппокампе крыс, переживших ТГ,посредством ингибирования HIF1. Вопрос о конкретных механизмах положительнойрегуляции ПФП гипоксией и реоксигенацией остается открытым и требует дальнейшихисследований.1015.
ЗАКЛЮЧЕНИЕВходевыполнениянастоящейработы,посвященнойрасшифровкенейропротективных механизмов гипобарического ПостК, а также оценке вклада HIF1 вреализациюпостгипоксическихэффектов,намибылопоказано,чтотяжелаягипобарическая гипоксия (ТГ) аналогично ишемическим моделям приводит к ап-регуляцииHIF1a через 1 день реокесигенации, однако в дальнейшем вызывая уменьшение егоколичества.
Также в результате гистохимического анализа TUNEL+ клеток иэлектрофоретического анализа фрагментации ДНК нами подтверждены ранее полученныев нашей лаборатории данные о ТГ-зависимой индукции апоптоза (Rybnikova et al., 2006,2012). При этом как инъекция ингибитора HIF1 перед ТГ, так и применение ПостКпредотвращают развитие апоптотических процессов.Важнейшимэлементомметаболизмамозга,вовлеченнымвподдержаниеантиоксидантных систем и обеспечение нормального окислительно-восстановительногостатуса за счет генерации восстановленного НАДФ, признан пентозофосфатный путь(ПФП) метаболизма глюкозы (Fernandez-Fernandez et al., 2012, Ben-Yoseph et al., 1996). Вчастности, недавно была показана существенная роль ПФП в предотвращении последствийокислительного стресса, индуцированного депривацией кислорода и глюкозы in vitro (SunS., et al. 2017).
В настоящем исследовании, с использованием HIF1-позитивной моделитрехкратной умеренной гипобарической гипоксии in vivo, мы показали обратную связьмежду активностью HIF1 и транскрипцией первого скорость-лимищеготирую ферментаПФП, Г6ФДГ, а также позитивную регуляцию экспрессии гена этого фермента гипоксиейи реоксигенацией.В модели ТГ краткосрочное увеличение количества HIF1a непосредственно послереоксигенации хоть и сопровождалось увеличением активности Г6ФДГ, но не приводило кэффективной наработке НАДФН, возможно за счет гиперактивации конкурирующего сПФП за субстрат гликолиза, как HIF1-зависимо на уровне транскрипции, так и вследствиеопосредованной гипоксией стимуляции активности PFKFB-3 (Semenza, 2001, FernandezFernandez et al., 2012).
В свою очередь уменьшение количества и активности Г6ФДГ иснижение уровня НАДФН в отсроченный постгипоксический период сопровождалосьформированием долгосрочного окислительного стресса в гиппокампе крыс, приводя кмассированной клеточной гибели.В связи с этим, ингибирование HIF1 перед ТГ, также, как и использование ПостКумеренной гипобарической гипоксией предположительно могли поспособствовать102предотвращению патологии, индуцируемой тяжелой повреждающей гипоксией. Врезультате проведенных нами исследований установлено, что использование ингибитораHIF1 перед ТГ предотвращает краткосрочную стимуляцию этого транскрипционногофактора, нормализует работу ПФП, усиливая восстановление НАДФ и нивелируяокислительный стресс, способствуя снижению свободнорадикального окисления липидови предотвращая запуск клеточной гибели по типу апоптоза.
ПостК также стабилизируетфункционирование ПФП, вероятно HIF1-независимым путем, нормализует редокс статус,количество глутатиона и предотвращает развитие апоптотических процессов.Функциональная значимость показанной нами роли ПФП в обеспечении защитныхреакций мозга на последствия тяжелых форм гипоксии косвенно подтверждается недавноопубликованными данными о протективном эффекте введения НАДФН в раннийпостинсультный период (Li et al., 2017).
Полученные нами данные объясняют этиологиюданного явления, расширяя современные представления о механизмах постгипоксическихпатологий и способствуя пониманию путей реализации антиапоптотического иантиоксидантного действия гипоксического посткондиционирования. Использованиеингибиторов HIF1 в ранний постинсультный период, а также введение НАДФН пациентам,пережившим инсульт, может оказаться эффективной нейропротективной стратегией.На Рисунке 34 представлено схематическое обобщение основных результатов,полученных нами в ходе выполнения настоящей работы.103Рисунок 34. Схема регуляции пентозофосфатного пути и связанных с пентозофосфатнымпутем процессов в гиппокампе крыс, переживших тяжелую гипоксию, тяжелую гипоксиюв сочетании с гипоксическим посткондиционированием либо на фоне ингибирования HIF1.1046. ВЫВОДЫ1. Тяжелая гипоксия вызывает развитие процессов клеточной гибели в мозге крыс,наиболеевыраженнопроявляющиесявгиппокампе.Гипоксическоепосткондиционирование оказывает противоапоптотическое действие в гиппокампе инеокортексе.2.
Тяжелая гипоксия вызывает уменьшение содержания противоапоптотического белкаBcl-2 в гиппокампе крыс, не оказывая влияния на нейротрофин BDNF в этой структуремозга, в то же время повышая содержание Bcl-2 и BDNF во втором слое сенсомоторнойкоры. Гипоксическое посткондиционирование способствует увеличению содержаниябелков Bcl-2 и BDNF как в гиппокампе, так и в неокортексе крыс, переживших тяжелуюгипоксию.3. Тяжелая гипоксия вызывает гиперэкспрессию HIF1a в СА1 поле гиппокампа в раннийпериод реоксигенации, ведя к отсроченному снижению содержания и активностиГ6ФДГ,уровняНАДФН,общегоглутатионаиснижениюокислительно-восстановительного статуса в гиппокампе крыс, не оказывая долгосрочного влияния наэти показатели в неокортексе.
Предъявление крысам, пережившим тяжелую гипоксию,умеренной гипобарической гипоксии в режиме посткондиционирования предотвращаетотсроченное уменьшение содержания и активности Г6ФДГ, в то же время, способствуянормализации количества НАДФН, общего глутатиона, редокс статуса и снижениюпроцессовсвободнорадикальногоокислениялипидоввгиппокампе,нонесенсомоторной коре крыс.4. Инъекция ингибитора HIF1 крысам перед тяжелой гипоксией способствуетпредотвращению процессов клеточной гибели в гиппокампе.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
