Диссертация (1145748), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Изучение динамики фрагментации ДНКФрагментация ДНК в гиппокампе крыс выявлена уже через два дня после окончаниясеанса тяжелой гипоксии (Рисунок 11, А). Это проявлется в формировании характерной«апоптотической «лестницы» на электрофореграмме, детектируемой по пикам на профилелюминесценции. При этом по крайней мере в течение четырех дней после ТГ фрагментацияДНК остается на высоком уровне.
Напротив, в гиппокампе животных, переживших один,два и три сеанса гипоксического ПостК, фрагментация ДНК не выявлена, что указывает наналичие противоапоптотического эффекта ПостК (Рисунок 11, А) для этой структурымозга.В отличие от гиппокампа, в неокортексе как посткондиционированных крыс, так иживотных, переживших ТГ без ПостК, не выявлено изменения фрагментации ДНК посравнению с контролем (Рисунок 11, Б), что указывает на меньшую чувствительностьнеокортекса крыс к повреждающему действию ТГ по сравнению с гиппокампом, либо наповышенную регенеративную способность данной структуры мозга.71Рисунок 11. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с сеансамипосткондиционирования (ТГ+ПостК) на фрагментацию ДНК в гиппокампе (А) инеокортексе (Б) крыс (электрофоретическое разделение в 2% агарозе; количество ДНК вкаждой пробе: 5мкг).4.01.01.02. Изучение количества TUNEL позитивных клетокГистохимическим методом анализа апоптотических процессов по соотношениюTUNEL-позитивных клеток к общему количеству клеток не выявлено апоптотическихпроцессов в течение первых трех дней после ТГ.
Однако, через 4 дня реоксигенации у крыс,переживших непосткондиционированную ТГ, наблюдается интенсивное повреждениеклеток гиппокампа и менее выраженное повреждение второго слоя сенсомоторной коры,сопровождающееся отсроченным запуском апоптоза (Рисунок 12). Так в CA1 полегиппокампа крыс, переживших ТГ, через 4 дня после воздействия количество TUNELпозитивных клеток составляет 43% от общего количества клеток. Во втором слоесенсомоторной коры крыс, переживших ТГ, интенсивность апоптотических процессовменее выражена, чем в гиппокампе (6% TUNEL-позитивных клеток относительно общегоколичество через 4 дня после реоксигенации).ПостК, предъявляемое после ТГ, оказывает выраженный нейропротективныйэффект, предотвращая отсроченное развитие апоптотических процессов в гиппокампе(0,42% TUNEL-позитивных клеток через 4 дня после ТГ) и неокортексе (TUNELпозитивные клетки не выявлены) (Рисунок 12).72Рисунок 12.
Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с тремясеансами гипоксического посткондиционирования (ТГ+3ПостК) на количество TUNELпозитивных клеток. Микрофотографии (40х) СА1 поля гиппокампа (А) и второго слоянеокортекса (Б) контрольных крыс (Контроль), через 4 дня после тяжелой гипоксии(ТГ+4дня) и через день после тяжелой гипоксии в сочетании с трехкратнымпосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией (ТГ+3ПостК+1день).Маркер, 100 мкм; График количестваTUNEL-позитивных клеток в СА1 поле гиппокампа и2м слое неокортекса (В). Количество TUNEL-позитивных клеток выражено в % от общегоколичества клеток.73* Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; # Различия достоверны поотношению к ТГ, p≤0.05.На данном этапе работы благодаря анализу фрагментации ДНК и количества TUNELпозитивных клеток был установлен факт повышенной интенсивности повреждениянейронов гиппокампа по сравнению с неокортексом в результате воздействия ТГ.
В то жевремя предъявление ПостК пережившим ТГ крысам способствует предотвращениюфрагментации ДНК и уменьшению количества TUNEL-позитивных клеток как в СА1 полегиппокампа, так и во втором слое неокортекса.4.01.02. Содержание проадаптивных белков Bcl-2 и BDNFС применением иммуногистохимического метода исследовали измененениесодержания маркеров нейропротекции, антиапоптотического белка Bcl-2 и нейротрофинаBDNF, в СА1 поле гиппокампа и втором слое сенсомоторной коры крыс.Среднююоптическую плотность иммунопозитивных к Bcl-2 и BDNF определяли через 75 и 96 часовпосле тяжелой гипоксии (ТГ) и, соответственно, через 3 и 24 часа после третьего сеансапосткондиционирования (ПостК).Содержание проадаптивных белков Bcl-2 и BDNF в СА1 поле гиппокампаЧерез 75 часов после ТГ средняя оптическая плотность иммунопозитивных по Bcl-2клеток в СА1 поле гиппокампа крыс достоверно не отличалется от контроля.
Через 96 часовреоксигенации количество Bcl-2 в данной структуре мозга уменьшается до 20% от контроля(Рисунок 13, А).В дорзальном гиппокампе (СА1 поле) крыс спустя 3 часа после последнего сеансаПостК (соответственно, через 75 часов после ТГ в этой группе) средняя оптическаяплотность иммунопозитивных к Bcl-2 клеток возрастает в три раза. Через 24 часа послезавершения трехкратного ПостК (соответственно, через 96 часов после ТГ) количество Bcl2 также увеличено и составляет 400% от базального уровня (Рисунок 13, А).Воздействие ТГ не приводит к изменению средней оптической плотностиэкспрессирующих BDNF клеток в СА1 поле гиппокампа спустя 75 часов после воздействия(Рисунок 13, Б). Через 96 часов после реоксигенации количество BDNF в дорзальномгиппокампе также не имеет достоверных отличий с контролем.74У ПостК животных выявлена up-регуляция содержания BDNF (Рисунок 13, Б).
Такчерез 3 часа после последнего сеанса ПостК количество BDNF возрастает до 500% отконтроля, а через 24 часа было в четыре раза выше базального уровня.Рисунок 13. Средняя оптическая плотность иммунопозитивных к Bcl-2 (A) и BDNF (Б)клеток в СА1 поле гиппокампа контрольных крыс (белые столбики) и через 75 и 96 часовпосле тяжелой гипобарической гипоксии у непосткондиционированных (черные столбики)и посткондиционированных животных (серые столбики).
По оси абсцисс - время послетяжелой гипоксии; по оси ординат – средняя оптическая плотность иммунопозитивныхклеток в % от контроля. *, различия с контролем статистически достоверны, р≤0.05; #,различия статистически достоверны по сравнению с ТГ, р≤0.05.Гипоксия является одним из видов воздействия, нарушающего гомеостаз организмаи вызывающего ответную реакцию, направленную на его восстановление. Но если этинарушения слишком велики и клетка не способна их компенсировать, то запускаютсямеханизмы ее повреждения и гибели. Тяжелые формы гипоксии способны вызывать целыйряд функциональных и структурных нарушений, обратимых и необратимых, что зависит отинтенсивности и длительности воздействия.
Настоящие результаты подтверждаютрезультаты предыдущих работ о деструктивном влиянии ТГ на нейроны уязвимыхобразований мозга крыс, сопровождающемся смещением соотношения факторов регуляциивыживания/гибели клетки в сторону проапоптотических белков на фоне подавленияэкспрессии антиапоптотических факторов (Rybnikova et al., 2006).
Нами показано, что ТГ75приводит к снижению уровня антиапоптотического белка Bcl-2 в СА1 поле гиппокампадаже на поздних сроках после воздействия (75-96ч), результатом чего становится гибельоколо 30% нейронов данной области через 7 дня после воздействия (Rybnikova et al., 2012).Применение ПостК УГГ в нашей модели в значительной степени способствуетпредотвращению нейрональной гибели (Rybnikova et al., 2012, раздел 4.01.01). Согласнополученным нами результатам, нейропротективный эффект ПостК может реализовыватьсяза счет вызываемой им ярко выраженной up-регуляции антиапоптотического фактора Bcl2, что согласуется с данными, полученными и в модели раннего ишемического ПостК (Xinget al., 2008).Регуляция транскрипции Bcl-2 осуществляется адаптивными транскрипционнымифакторами CREB, NF-кB (Chiueh et al., 2005, Karin et al., 2002). Мобилизация CREB (за счетфосфорилирования) была продемонстрирована при изучении эффекта ишемического (Haraet al., 2003) и гипобарического (Чурилова и др., 2009) прекондиционирования.
Следуетотметить,чтогипоксическоепрекондиционирование,гипобарическое, увеличивало экспрессиюкакишемическоетакиNF-кB, хотя тяжелая гипоксия/ ишемияприводила к снижению его экспрессии (Blondeau et al., 2001, Чурилова и др., 2009).По данным литературы NF-кB и CREB также активируют экспрессию нейротрофинаBDNF (Herdegen et al., 1998, Knapska et al., 2004). В нашем исследовании полученырезультаты, согласно которым в СА1 поле гиппокампа крыс, переживших тяжелуюгипобарическую гипоксию с последующим ПостК происходит значительное увеличениеэкспрессии этого нейротрофина, что свидетельствует о вероятном участии данного факторав компенсаторном действии ПостК.
Одной из мишеней рецептора BDNF (TrkB) являетсяPI3K (phosphatidylinositide 3-kinases).Известно, что селективное ингибирование PI3Kнивелирует нейропротективный эффект ишемического ПостК (Scartabelli et al., 2008).Наряду с Akt сигналлингом, взаимодействие BDNF с рецептором также может приводить кзапуску MAP киназного (Erk1/2) каскада, способствующего активации транскрипциинейропротективных генов (Howe et al., 2001).Таким образом, на данном этапе работы нами установлено, что реализациянейропротективного действия ПостК УГГ при коррекции постгипоксической патологиисопровождается over-экспрессией Bcl-2 и BDNF в СА1 поле гиппокампа, вероятно,выполняющихрольэффекторовструктурно-функциональнойповреждающего воздействия.нейропротективныхреабилитацииклетокпроцессов,гиппокампаспособствующихпослетяжелого76Содержание проадаптивных белков Bcl-2 и BDNF во втором слое неокортексаТяжелая гипоксия приводит к изменению содержания Bcl-2 и BDNF во втором слоенеокортекса крыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
