Диссертация (1145748), страница 10
Текст из файла (страница 10)
И.П. Павлова РАН. Животных содержали встандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты былипроведены согласно требованиям, сформулированным в Директивах Совета Европейскогосообщества(86/609/ЕЕС)обиспользованииживотныхдляэкспериментальныхисследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращениюс животными Института физиологии им. И.П.Павлова РАН. Все измерения проведеныминимум в двух повторностях с использованием материалов из независимыхэкспериментов. В каждой экспериментальной группе (контрольной или опытной) накаждой временной точке использовано не менее 6 животных.3.02.
Модель гипобарической гипоксииГипобарическая гипоксия – гипоксическое воздействие, вызываемое общимуменьшением атмосферного давления в окружающей среде. Создаваемая в барокамерегипобарическаягипоксияможетрассматриватьсякакимитацияподъеманасоответствующую высоту в горах. В наших исследованиях была использована модельгипобарической гипоксии, создаваемой в барокамере проточного типа (Рисунок 7), в трехрежимах: тяжелая повреждающая гипоксия (ТГ), ТГ в сочетании с последующейтрехкратной умеренной гипобарической гипоксией (3УГГ), используемой в качествепосткондиционирующего воздействия (ПостК), а также 3УГГ без предварительной ТГ,используемая в качестве HIF1-позитивной модели для анализа зависимости междуактивностью этого фактора транскрипцией гена ключевого фермента ПФП – Г6ФДГ.49Рисунок 7.
Барокамера проточного типа для создания гипобарической гипоксии вразличных режимах.3.02.01.Режим тяжелой повреждающей гипоксииДля создания условий ТГ животных помещали в барокамеру проточного типа(Рисунок 7), снижали давление до 180 мм.рт.ст (содержание кислорода 5%). Длительностьвоздействия 3 часа. «Подъем» на соответствующую высоту производили, начиная с 760мм.рт.ст и далее ступенчато понижали давление на 100 мм.рт.ст. каждую минуту додостижения отметки в 180 мм.рт.ст. Данный способ подъема помогал избежать резкогоперепада давления, позволяя крысам адаптироваться. Продув камеры воздухомосуществляли каждые 20 минут с целью поддержания нормального соотношения газов иизбежания гиперкапнии.
Примерно пятьдесят процентов животных не выживали вусловиях ТГ и, соответственно, они были исключены из опыта.Декапитацию животных для взятия головного мозга осуществляли гильотинойнепосредственно после сеанса ТГ (для анализа продуктов ПОЛ) или через 1, 2 и 4 дня послеТГ. Животные контрольной группы, не подвергавшиеся гипоксическому воздействию,проходили соответствующие процедуры пребывания в барокамере и были выведены изэксперимента через 1 день после введения ингибитора HIF1 либо инъекционного контроля(смесь ДМСО : NaCl в пропорции 1:1, см.
раздел 3.03) . После декапитации на холоде50изолировали головной мозг, выделяли гиппокамп и неокортекс и быстро замораживали вжидком азоте либо помещали в фиксирующий раствор (FineFix, Millestone, Италия) дляпоследующего проведения гистологического анализа.3.02.02.Режимпосткондиционированиятрехкратнойумереннойгипобарической гипоксиейС целью ПостК применяли умеренную гипобарическую гипоксию. При этомдавление в барокамере составляло 360 мм рт.ст.
(содержание кислорода 10%). Как и приТГ, снижение давления в барокамере проводили ступенчато.Крыс подвергали умеренной гипобарической гипоксии трижды (продолжительностьвоздействия - 2 часа), с интервалом 24 часа. Первый сеанс осуществлялся через 24 часапосле ТГ, поскольку ранее в нашей лаборатории было показано, что это наиболееэффективный режим посткондиционирования (Rybnikova et al., 2012). Декапитациюживотных для взятия головного мозга осуществляли гильотиной через 1 день после первогоили третьего сеансов ПостК.
Животные контрольной группы, не подвергавшиесягипоксическому воздействию, проходили соответствующие процедуры пребывания вбарокамере и были выведены из эксперимента через 1 день после введения ингибитораHIF1 либо ДМСО. Извлекали мозг, выделяли гиппокамп и неокортекс и быстрозамораживали в жидком азоте либо, для проведения гистологического анализа, помещалив фиксатор.3.02.03.Режим трехкратной умеренной гипобарической гипоксииДля проверки взаимосвязи между гипоксией/реоксигенацией, активностью HIF1 иэкспрессией мРНК Г6ФДГ использовали HIF1-позитивную модель трехкратной умереннойгипобарической гипоксии (Samoilov et al., 2015).
Условия 3УГГ создавались в барокамерепосредством понижения давления до 360 мм рт.ст. (содержание кислорода 10%). Крысподвергали умеренной гипобарической гипоксии трижды (продолжительность воздействия- 2 часа), с интервалом 24 часа. Декапитацию животных для взятия головного мозгаосуществляли гильотиной через 3 и 24 часа после третьего сеанса УГГ.
Животныеконтрольной группы, не подвергавшиеся гипоксическому воздействию, проходилисоответствующие процедуры пребывания в барокамере и были выведены из экспериментачерез 5 и 27 часов после введения ингибитора HIF1 либо через 27 часов после введения51ДМСО. Из извлеченного мозга выделяли гиппокамп, гомогенизировали в тризоле (TRIzol™Reagent, Thermo Fisher Scientific) для дальнейшей экстракции общей РНК и хранили притемпературе +40С.3.03.
Постановка экспериментов с использованием ингибитора HIF1С целью оценки вклада гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF1) в изучаемыепроцессы использовали ингибитор HIF1 - топотекан (Ban et al., 2011, Rapisarda et al., 2009).Топотекан растворяли в смеси ДМСО : 0,09 % NaCl в пропорции 1:1 и вводилиживотным внутрибрюшинно в расчете 5 мг/кг веса за 10 минут до каждого гипоксическогосеанса (группы тяжелая гипобарическая гипоксия + ингибитор (ТГ + HIF1i) либотрехкратная умеренная гипобарическая гипоксия + ингибитор (3УГГ + HIF1i)).В качестве инъекционного контроля использовали смесь ДМСО : 0,09 % NaCl(группы ТГ, ТГ + посткондиционирование (ПостК) либо 3УГГ). Не подвергавшимсягипоксическим воздействиям крысам также вводили топотекан для ингибирования HIF1(контроль + HIF1i) либо смесь ДМСО : 0,09 % NaCl (контроль).3.04.
Гистохимические методы3.04.01. Гистологическая обработка ткани и изготовление парафинизированныхсрезов мозгаОбразцы ткани мозга фиксировали в молекулярном фиксаторе FineFix (разведение:28 мл фиксатора + 72 мл 96% этанола, Milestone, Italy) в течение 24 часов при температуре+40С. Затем образцы обезвоживали, проводя через этанол возрастающих концентраций(50%→70%→80%→96%→96% по 1 часу инкубации в каждом). На ночь образцы тканиоставляли в бутаноле.
Затем материал проводили через 2 порции ксилола (по 30-40 мин),помещали в парафин (2 смены парафина, по 1 часу в каждой) в термостате при температуре+560С и изготавливали парафиновые блоки.На ротационном микротоме (Reichert, Austria) изготавливали серийные срезы мозгаво фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне -2.80 мм от брегмы (Paxinos, 1986).Для изучения были выбраны СА1 поле гиппокампа и второй слой сенсомоторной коры всвязи с тем, что эти структуры считаются образованиями мозга, наиболее уязвимыми кгипоксии (Kumar et al.
2016). Полученные срезы монтировали на предметные стекла,52обработанные поли-лизином. Далее срезы депарафинизировали в ксилоле (2 смены по 5мин) и подвергали регидратации в спиртах (96% - 96% - 96% - 70% по 5 мин в каждом).Для оценки содержания и локализации белков интереса в структурах мозгаиспользовалииммуногистохимическийметод,адляанализаинтенсивностиапоптотических процессов – метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nickend labeling).3.04.02.
Иммуногистохимический метод детекции белковИммуногистохимический метод – метод выявления точной локализации того илииного клеточного или тканевого компонента (антигена) in situ благодаря связыванию его сспецифичными меченными антителами.3.04.02.01. Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозгаСодержание белков Bcl-2, BDNF, HIF1a, эритропоэтина, Г6ФДГ в СА1 полегиппокампа и втором слое неокортекса крыс определяли методом непрямого окрашиванияс использованием авидин-биотинового комплекса – АВС (аббревиатура от английскогоAvidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex), предполагающимиспользование первичных (антиген-специфичных) и вторичных (специфичных кпервичным антителам) антител (Рисунок 8).Рисунок8.Схема,иллюстрирующаяиммуногистохимического окрашивания.принципABCметоданепрямого53Первичные антитела реагируют с антигенами ткани.
Связанные с меткой вторичныеантитела специфически взаимодействуют с первичными, которые для вторичных антителявляются антигеном. Метод значительно чувствительнее прямого, так как с каждоймолекулой первичных антител связывается несколько молекул вторичных антител,апервичные антитела не несут на себе лишнего «груза» в виде метки, благодаря чему легчеи быстрее проникают в ткани.Использовали следующие реактивы:1)Фосфатный буфер: 0,02М Na2HPO4, 0,003M NaH2PO4, 0,14M NaCl (pH 7,4).2)Цитратный буфер (0.01М , pH 6.0).3)Нормальная сыворотка: 1% BSA (bovine serum albumin) буфер, содержащий также0,3 % тритона Х-100, 0,2 % бацитрацина, 0,1 % NaN3 в PBS (Vectastein ABC kit, VectorLaboratories, Inc, USA).4)Первичные поликлональные кроличьи антитела против белков интереса (разведениев PBS 1:50), Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA.5)Вторичные биотинилированные антитела (разведение в PBS 1:200), Vectastein ABCkit, Vector Laboratories, Inc, USA.6)Авидин-биотиновый комплекс (АВС), Vectastein ABC kit, Vector Laboratories, Inc,USA.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
