Диссертация (1145748), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Для проверки качества переноса белков на мембрану использовалиокрашивание Ponceau S Red (MP Biomedicals, USA), выявлявшее полосы сорбирования,затем отмывали дистиллированной водой. Процедуры окрашивания и отмывки проводилина шейкере.3.05.05. Иммунодетекция белков на мембранеВсе процедуры окрашивания и отмывки проводили на шейкере. Мембранупромывали в ТBS-T буфере рН 7.6 два раза по 5 мин. Буфер TBS-T (Tris-Buffered SalineTween-20) готовили из стокового 10-кратного раствора TBS (0,2М трис-НСl, 1,3М NaCl, рН597,6) разведением в 10 раз и добавлением Tween до 0,1%. Затем в течение 1 часа проводилиблокировку мест неспецифической сорбции антител на мембрану с помощьюблокирующего буффера: 3% BSA (Sigma, USA) в TBS (15 мл на мембрану), после чегодважды ополаскивали TBS-T.Нитроцеллюлозные мембраны затем последовательно инкубировали в течение часав растворах, содержащих первичные кроличьи антитела, специфичные к HIF1a,эритропоэтину, Г6ФДГ, Bcl-2, BDNF (разведение 1:500 - 1:1000 или 0,2-0,4 мкг/мл, SantaCruz Biotechnology, USA) и вторичные противокроличьи антитела (1:1000 - 1:2000, Dako,Germany).
В качестве контроля использовали антитела к актину-бета (Sigma, USA).Инкубацию с антителами I, растворёнными в 15 мл TBS, содержащего 0,3%, проводили втечение 1-2 часов при комнатной температуре, отмывали от не связавшихся антител в TBST 2 раза по 10 мин. Инкубация со вторичными, конъюгированными с пероксидазой хрена,антителами, растворёнными в 15 мл TBS продолжалась затем около 1 часа. Далее мембранутщательно отмывали в TBS-T 2 раза по 10 мин.Визуализациюбелковнанитроцеллюлозехемилюминесцентнымметодомпроводили с использованием наборов ECL - Enhanced chemiluminescence: STAR-GLO (MPBiomedicals, USA) или SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific, USA).
Эти системысодержат примерно 0,8% люминола, 0,07% кумаровой кислоты и 0,03% перекиси водорода.Для обнаружения люминесценции смешивали растворы реагента 1 и реагента 2 из набора всоотношении 1:1 из расчета 0,125 мл/см2 и наносили на мембрану на 1 мин при комнатнойтемпературе. Затем в темноте совмещали блот с рентгеновской пленкой Kodak иэкспонировали в течение от 30 секунд до 5 минут в зависимости от силы свечения.Дальнейшие действия также осуществляли в темноте. Рентгеновскую плёнку проявляли втечение 2-5 мин. Ополаскивали водой и фиксировали 5 мин в фиксаже (из готовыхнаборов). Далее пленки высушивали и сканировали. Используя программу ImageJ,производили определение количества исследуемых белков в образцах по интегральнойоптической плотности, нормируя на интегральную оптическую плотность полос,соответствующих бета-актину.Результаты, полученные методом иммуноблоттинг, в диссертации не представлены,так как данный вспомогательный этап работы осуществлялся для проверки специфичностиантител.
Используя этот метод, мы смогли убедиться в высокой специфичностикоммерческих антител, которые применяли в своих экспериментах.603.06. Выделение и электрофоретический анализ фрагментации ДНК дляопределения интенсивности процессов клеточной гибелиДля оценки процессов клеточной гибели выделяли ДНК из гиппокампа инеокортексакрыс,пережившихТГлибоТГвсочетаниисгипоксическимпосткондиционированием, при помощи экстрагирующего буфера, содержащего 2%детергент цетилтриметиламмоний бромид, 1,4М NaCl, 0,02М ЭДТА (pH 8.0), 0,01М ТрисНСl (pH 8.0) (инкубация 30 минут при 60ºС).
Пробы отмывали от липидных примесейхлороформом, после чего ДНК осаждали изопропанолом и обессоливали 70% этанолом.Осадок после сушки растворяли в воде. Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом вгоризонтальном 1 % агарозном геле (7 см/8 см/0.3 см) в буфере ТАЕ (0.04 М трис-ацетат,0.002 М ЭДТА, pH 8.0). Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически припомощи прибора BioPhotometer plus (Eppendorf, Germany), предоставленного РесурснымЦентром«Обсерваторияэкологическойбезопасности»НаучногопаркаСанкт-Петербургского Государственного Университета.Для выявления ДНК в агарозный гель вводили бромистый этидий до конечнойконцентрации 0,4 мкг/мл. В карманы геля вносили раствор, содержащий 5 мкг ДНК,краситель бромфеноловый синий и утяжелитель (20% глицерин).
В качестве стандартовиспользовали GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, USA).Электрофорез проводили при 50 В в течение 2,5 часов. Детекцию осуществляли с помощьюгель-документирующей системы ChemiDoc с ручным управлением в ультрафиолетовомсвете при длине волны 310 нм.3.07. Спектрофотометрический метод определения содержания общего белкаПри проведении измерения активности Г6ФДГ, количества НАДФН, тиоловыхгрупп, общего глутатиона, ТБК-активных продуктов параллельно осуществляли измерениеколичества общего белка с целью последующий нормировки данных. Количество белка вкаждой пробе определяли непосредственно перед экспериментом с помощью фотометраBiophotometer plus Eppendorf (Eppendorf, Германия). 20 мкл пробы разводилидистиллированной водой до конечного объема 1 мл. Оптическая плотность измерялась надлинах волн 260, 280 и 340 нм согласно стандартному протоколу Eppendorf.
Результатыопределения концентрации белка выражали в мг/мл раствора. Измерения проводились набазе ресурсного центра «Обсерватория экологической безопасности» Научного ПаркаСПбГУ.613.08. Определение активности Г6ФДГДля определения активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) вгиппокампеинеокортексекрысиспользоваликоммерческийнабордляколориметрического анализа (MAK015, Sigma-Aldrich).Образцы ткани гиппокампа или неокортекса весом 20 мг гомогенизировали в 500мкл холодного фосфатного буфера (рН 6.5-8).
Далее гомогенаты переливали вмикропробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 15 000g для удалениянерастворимого материала. После этого 200 мкл супернатанта переливали в чистыепробирки и отдельно отбирали 50 мкл супернатанта для измерения общего количествабелка. По 20 мкл пробы в двух параллелях наносили в лунки 96-луночного планшета идоводили до конечного объема 50 мкл, используя Assay Buffer.Для детекции активности Г6ФДГ в каждую лунку вносили по 50мкл Master ReactionMix (46 мкл G6PD буфера: 2мкл G6PDH Substrate Mix: 2мкл G6PDH Developer),перемешивали при помощи горизонтального шейкера в течение 1 минуты, после чегопереносили планшет в микропланшетный спектрофотометрический ридер SPECTROstarOmega (BMG Labtech, Germany), термостатируемый при +37°C, и через 2 минуты начиналиизмерение оптической плотности при длине волны 450 нм.
Инкубировали планшет при+37°C с проведением измерений (A450) через каждые 2 минуты в течение 30 минут додостижения значений оптической плотности самого активного образца больше, чемзначение самого высокого стандарта.Активность Г6ФДГ в экстрактах гиппокампа и неокортекса расчитывали по формуле:Г6ФДГ активность = [НАДН нмоль]/ (Время реакции (мин) * Объём пробы в лунке (мл) *[белка мг/мл])623.09. Определение количества НАДФНКоличество продукта ПФП - восстановленного НАДФ, в гиппокампе и неокортексеопределяли при помощи количественного колориметрического набора (MAK038, SigmaAldrich). Для этого 30 мг ткани промывали холодным PBS, гомогенизировали 500 мклExtraction Buffer, после чего инкубировали в микропробирках на льду в течение 10 минут.Далее образцы центрифугировали в течение 10 минут при 10000g для удалениянерастворимого материала. После этого 150 мкл супернатанта переливали в чистуюпробирку и отдельно отобирали 50 мкл супернатанта для определения общего белка.Далее пробы (по 150 мкл) инкубировали в эпендорфах в течение 30 минут при +60ᵒC,после чего охлаждали на льду и центрифугировали 10 минут при 10 000g для удалениянерастворимого материала.
Для детекции использовали Master Reaction Mix (98,5 мклNADP Cycling Buffer : 1,5 мкл NADP Cycling Enzyme Mix) из расчета 100мкл/на реакцию.Две аликвоты по 50 мкл из каждой пробы вносили в лунки 96-луночного планшета(в лунки вносили каждую пробу в двух параллелях), добавляли 100 мкл Master Reaction Mixв каждую лунку, перемешивали горизонтальным шейкером и инкубировали 5 минут прикомнатной температуре для конвертирования НАДФН в НАДФ. Далее в каждую лункудобавляли по 10 мкл раствора NADPH Developer и инкубировали при комнатнойтемпературе в течение 4 часов в микропланшетном спектрофотометрическом ридереSPECTROstar Omega (BMG Labtech, Germany), производя измерения оптической плотностипри 450 нм каждую минуту. Реакцию останавливалиь добавлением 10 мкл Stop Solution ихорошо перемешав.
Окрашивание стабильно в течение 48 часов в герметически закрытомпланшете после добавления стоп-раствора.Количество НАДФН в пробах определяли по калибровочной кривой и выражали впг/мг белка.633.10. Экстракция цитозольной фракции из гиппокампа и неокортекса крысДля выделения цитозольной фракции гиппокампа и неокортекса крыс с цельюдальнейшего анализа количества тиоловых групп, свидетельствующих об окислительновосстановительном статусе, и общего глутатиона использовали метод дифференциальногоцентрифугирования в растворе сахарозы (Rodrigues and Pellegrino 1986). Фрагментгиппокампа или неокортекса весом около 50 мг гомогенизировали вручную на льду всистеме стекло-стекло в 2 мл 0,3 М раствора сахарозы на 1мМ ЭДТА, 0,2 М Трис-HCl (рН7,4). Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 1500g и температуре 4ᵒС.Супернатант содержал цитозольную фракцию, микросомы и митохондрии.
В осадкеоставались негомогенизированные клетки, ядра клеток и крупные обрывки клеточныхмембран. Супернатант подвергали повторному центрифугированию в течение 20 минутпри 9000g и температуре 4ᵒС. Полученный супернатант содержал цитозольную фракцию;его замораживали и хранили при температуре -80оС.3.11. Измерение содержания восстановленных тиоловых групп и общегоглутатионаМетодика основана на реакции восстановленных тиогрупп цистеина в составебелков или глутатиона с 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (DTNB) с образованиемокрашенного продукта 2-нитро-5-тиобензойной кислоты (TNB) (Рисунок 10), поглощениекоторого можно детектировать спектрофотометрически на длине волны 412 нм (Akerboom,1981).Определениесодержанияобщегоглутатионапроводитсявбезбелковомцентрифугате.
Для осаждения белка могут быть использованы трихлоруксусная, уксусная,молибденовая, сульфосалициловая и метафосфорная кислоты. Согласно литературнымданным, этот этап лучше всего проводить с помощью 2 M перхлорной кислоты, которуюдобавляют к раствору пробы в соотношении 1:1 по объему. После этого рН пробы доводятдо 7 при помощи 2 М гидроксида калия. Специфичность данного метода достигаетсядобавлением в среду глутатион редуктазы, которая восстанавливает окисленную формуглутатиона, что приводит к взаимодействию с DTNB общего количества трипептида(Akerboom, 1981).64Рисунок 10. Реакция DTNB с тиоловой группой с образованием смеси дисульфидатионитробензоаттиола и стехиометрических количеств 2-нитро-5-тиобензойной кислоты(TNB) (Caldeira et al., 2013).3.11.01. Измерение содержания тиоловых группДля измерения количества тиоловых групп, свидетельствующих о состоянииокислительно-восстановительного статуса в цитозольной фракции гиппокампа инеокортекса, использовали следующие реактивы:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
