Диссертация (1145748), страница 13
Текст из файла (страница 13)
1,5 мг 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотs (DTNB, Sigma Ald., США) в 1 мл 0,5 %бикарбонате натрия (NaHCO3).2. Буфер фосфата калия (0,1 М), содержащий 1 мМ ЭДТА (рН 7,0).3. Восстановленный глутатион (AppliChem., Германия) для построения калибровочнойкривой.Готовили реакционную смесь из расчета 5 мкл DTNB и 138 мкл фосфатного буферана лунку.
В лунки вносили по 25 мкл 10-кратно разведенной цитозольной фракциигиппокампа или неокортекса крыс либо (для построения калибровочной кривой) растворавосстановленного глутатиона либо Н2О (в качестве фотометрического контроля). В каждуюлунку добавляли по 143 мкл реакционной смеси. Измерение оптической плотностипроводили на спектрофотометрическом микропланшетном ридере SPECTROstar Nano65(BMG Labtech, Германия) при длине волны 412 нм и комнатной температуре в течение 10минут.Количество тиоловых групп в цитозольной фракции гиппокампа и неокортексаопределяли по калибровочной кривой и выражали в нмоль/мг белка.3.11.02.Определение содержания общего глутатионаДля измерения количества общего глутатиона, основного антиоксиданта мозга, вцитозольной фракции гиппокампа и неокортекса, использовали следующие реактивы:1.
1,5 мг 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотs (DTNB, Sigma Ald., США) в 1 мл 0,5 %бикарбонате натрия (NaHCO3).2. Буфер фосфата калия (0,1 М), содержащий 1 мМ ЭДТА (рН 7,0).3. Восстановленный глутатион (AppliChem., Германия) для построения калибровочнойкривой.4. Глутатион редуктаза (GRed) (Sigma Ald., США) – конечная концентрация в лунке 6 U/мл.5. 4,5 мг NADPH (AppliChem., Германия) в 1 мл 00,5 % бикарбонате натрия (NaHCO3).6. Раствор HClO4 (2М);7. Раствор KOH (2М).Готовили реакционные смеси 1, содержащую 12,5 мкл NADPH, 5 мкл DTNB и 125мкл буфера в расчете на 1 лунку, и 2, содержащую необходимый объем GRed, разведеннойв 130 мкл буфера. Для депротеинизации проб цитозольной фракции структур мозга крыс к80 мкл пробы приливали 80 мкл HClO4, инкубировали 10 минут на льду, после чегоцентрифугировали при 7800g и температуре +4ᵒС в течение 7 минут.
Отбирали 100 мклсупернатанта и осуществляли нейтрализацию рН с помощью раствора КОН (80 мкл), послечего повторно центрифугировали при 7800g и температуре +4ᵒС в течение 7 минут. В лунки96-луночного планшета вносили по 25 мкл супернатанта либо раствора восстановленногоглутатиона (для калибровочной кривой) либо Н2О (для фотометрического контроля).Вносили 143 мкл реакционной смеси 1.
Быстро вносили 130 мкл реакционной смеси 2.Измерениелинейногоувеличенияоптическойплотностипроводилинаспектрофотометрическом микропланшетном ридере SPECTROstar Nano (BMG Labtech,Германия) при длине волны 412 нм в течение 10 минут.66Количество общего глутатиона в цитозольной фракции гиппокампа и неокортексаопределяли по калибровочной кривой и выражали в нмоль/мг белка.3.12. Измерение количества продуктов перекисного окисления липидовДля определения интенсивности процессов свободнорадикального окисленияиспользовали методы анализа продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) вгиппокампе и неокортексе. Все процедуры проводили при +4°С. Из головного мозгаизвлекали гиппокамп и неокортекс, после чего образцы гомогенизировали в 10-кратномобъеме смеси хлороформ - метанол (2:1) (с последующей экстракцией липидной фракциипо Фолчу (Folch, 1957) для определения диеновых, триеновых коньюгатов, коэффициентаКлейна и оснований Шиффа либо в буфере трис-HCl, содержащим KCl (30мМ трис-HCl,100мМ KCl, pH=7,4) для определения ТБК-активных продуктов.3.12.01.
Анализ диеновых, триеновых конъюгатов и коэффициента Клейна1мл хлороформной фазы упаривали досуха в водяной бани, растворяли в смесиметанол – гексан (5:1) и с использованием спектрофотометрического микропланшетногоридера SPECTROstar Nano (BMG Labtech, Германия) определяли содержание диеновых итриеновых конъюгатов спектрофотометрически при 233нм и 274нм соответственно.Количество выражали в единицах оптической плотности, нормированных на количествообщих фосфолипидов. Кроме этого, регистрировали оптическую плотность липидногоэкстракта при 215нм и рассчитывали индекс Клейна =Е233/E215, характеризующегостепень окисленности липидов.3.120.2.
Измерение количества оснований ШиффаИз липидного экстракта отбирали 1мл (0,5мл), выпаривали досуха и растворяли вхлороформе. Содержание Шиффовых оснований определяли флюориметрическим методомс помощью спектрофлуориметрического планшетного ридера FLUOstar Omega (BMGLabtech, Германия), предоставленного Ресурсным Центром «Обсерватория экологическойбезопасности» Научного парка Санкт- Петербургского Государственного Университета.67Измерения проводили при максимуме возбуждения 365нм и максимуме испускания425 нм, выражая в относительных единицах флюоресценции, соотнесённых к общемуколичеству фосфолипидов.3.12.03. Определение количества фосфора общих фосфолипидовКоличество фосфолипидов оценивали спектрофотометрически при 830нм посодержанию неорганического фосфора методом Бартлетта (Bartlett, 1959).3.12.04.
Определение количества ТБК-активных продуктовИз гомогенатов гиппокампа или неокортекса, пригитовленных на трис-НС1 буфере,отбирали по 0,5 мл, добавляли по 0,5 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 0,25мл0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты, перемешивали, нагревали на водяной бане(+100˚С)20мин.Затемохлаждалииобразовавшийсяокрашенныйкомплексэкстрагировали 1,5мл бутанола. Пробы тщательно перемешивали и центрифугировали 10мин при 3000g, отбирали бутанольную фракцию и фотометрировали при 532нм наспектрофотометрическом микропланшетном ридере SPECTROstar Nano (BMG Labtech,Германия). Также учитывали вклад неспецифического поглощения (светорассеяния),который оценивался по величине оптической плотности при 600нм.Содержание ТБК-активных продуктов выражали в единицах оптической плотности,нормированныхнаколичествоспектрофотометрическим методом.общегобелкавпробе,определенного683.13.
Количественный анализ транскрипции Г6ФДГ методом ПЦР в реальномвремениОбщую РНК изолировали из гиппокампа крыс с использованием коммерческогонабора Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA), предназначенного длявыделения РНК, согласно инструкциям производителя. Синтез кДНК производили из 1 мкгобщей РНК при помощи RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific).КоличественнуюПЦРвреальномвремениосуществлялисиспользованиемфлуоресцентного красителя SYBR green на термоциклере CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA).
Последовательности праймеров, температура отжига и размер фрагментовпредставлены в таблице 1.Таблица 1. Характеристики используемых праймеров.Уровень экспрессии гена интереса (Г6ФДГ) определяли, используя ΔΔCt метод,нормализуя данные на количество мРНК референтного гена актина-бета.693.14. Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку проводили с помощью пакетов анализа данныхSTATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel, использовали непараметрический критерийМанн-Уитни (Mann-Whitney U-test). Изменения считали достоверными при p≤0,05.Также дополнительно результаты обрабатывали с использованием скриптов насвободном статистическом языке R (https://cran.r-project.org/) в ресурсном центре«Обсерватория экологической безопасности» научного парка СПбГУ. Для анализа ипостроения графиков использовали метод бутстреп.
Оценку статистической значимостипроводили с использованием непараметрического теста Крускала-Уоллиса (The Kruskal–Wallis test). Результаты считали достоверными при р≤0,05.Все результаты в диссертации представлены в процентах от контроля (исключения:для TUNEL-позитивных клеток в процентах от общего числа клеток, для количества мРНКГ6ФДГ – в условных единицах отношения мРНК Г6ФДГ к мРНК актина-бета) в видесреднего арифметического ± SEM (стандартная ошибка среднего).705. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ4.01. Эффекты тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией нагиппокамп и неокортекс крыс4.01.01. Анализ процессов клеточной гибелиНа первых этапах работы с целью изучения влияния тяжелой гипоксии (ТГ) и ТГ всочетании с сеансами гипоксического посткондиционирования (ПостК) на процессыклеточной гибели в гиппокампе и сенсомоторной коре крыс использовали биохимическийметод электрофоретического анализа фрагментации ДНК, а также определяли соотношениеколичества апоптотических клеток к общему количеству клеток гистохимическим методомTUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling - dUTP концевоемечение ДНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой).4.01.01.01.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
