Диссертация (1145748), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Изучение роли HIF1 в реализации эффектов тяжелой гипоксии в гиппокампекрыс4.02.01. Количество TUNEL позитивных клеток в СА1 поле гиппокампаПосредством ингибирования трансляции HIF1 топотеканом нами был изученоучастие данного транскрипционного фактора в развитии апоптотических процессов вгиппокампе крыс, переживших ТГ.
Как было продемонстрировано в предыдущем разделе,ТГ вызывает отсроченное повреждение клеток СА1 поля гиппокампа: через 1 день послеТГ TUNEL-позитивные клетки не выявлены, однако через 4 дня после ТГ их количестводостигает 47% от общего количества клеток (Рисунок 23, 24).Однако, введение ингибитора HIF1 перед сеансом повреждающей гипоксииприводит к существенному уменьшению количества TUNEL-позитивных клеток (1,79% отобщего количества клеток) (Рисунок 23, 24)Рисунок 23.
Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксиив сочетании с ингибированием HIF1 (ТГ+HIFi) на количество TUNEL-позитивных клетокчерез 4 дня после реоксигенации в СА1 поле гиппокампа крыс. Маркер, 100 мкм.90Рисунок 24. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIFi) на количество TUNEL-позитивных клеток через 4 дняпосле реоксигенации в СА1 поле гиппокампа крыс. Количество TUNEL-позитивных клетоквыражено в % от общего количества клеток.
*, Различия достоверны по отношению кконтролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Среди множества гипотетических нейропротективных стратегий при коррекциипостинсультных патологий наиболее логичным на первый взгляд является использованиефармакологических агентов, направленных на мобилизацию активности HIF1 (Siddiq et al.2005). Однако постинсультные больные уже находятся в состоянии реокигенации, когдаметаболическиеперестройки,запускаемыеэтимтранскрипционнымфактором,потенциально могут носить дезадаптивный характер. На данном этапе выполненияисследования нами получены свидетельства запуска апоптоза в гиппокампе крыс вотсроченный постгипоксический период, а также представлены результаты, согласнокоторым инъекция ингибитора HIF1 перед ТГ оказывает мощный противоапоптотическийэффект, что согласуется с ранее полученными данными о вовлечении HIF1 в реализациюпатогенеза постишемических патологий (Chen et al., 2009, Sun Y., et al.
2017).914.02.02. Влияние ингибирования HIF1 на содержание HIF1a, эритропоэтина и Г6ФДГв СА1 поле гиппокампаСодержание HIF1a, белкового продукта его транскрипционной активности,цитокинаэритропоэтина,иключевогоскрость-лимитирующегоферментапентозофосфатного пути, Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа крыс изучали через 1,2 и 4 дняпосле ТГ и ТГ в сочетании с предварительным ингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i).С помощью иммуногистохимического анализа содержания HIF1а в СА1 полегиппокампа (Рисунок 25, 26) нами было показано, что через 1 день после ТГ происходитувеличение средней оптической плотности иммунопозитивных к HIF1а клеток до 180% отконтроля, после чего средняя оптическая плотность иммунопозитивных клеток снижается(Рисунок 26)).При введении крысам ингибитора HIF1 перед сеансом ТГ через 1 день после началареоксигенации up-регуляция HIF1a не наблюдается (Рисунок 25, 26), что можно былоожидать, исходя из сведений о механизме действия топотекана, блокирующего трансляциюэтого транскрипционного фактора.
В отсроченном периоде после ТГ уровень HIF1a неотличается от контроля (Рисунок 25, 26), однако происходит уменьшение содержанияэритропоэтина, белкового продукта транскрипционной активности HIF1 (59, 58, 44% отконтроля через 1, 2 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 27, 28).92Рисунок 25. Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксиив сочетании с ингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на количество HIF1a в CA1 полегиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ.
Маркер, 100мкм93Рисунок 26. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивныхк HIF1a клеток в CA1 поле гиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ.
*, Различия достоверныпо отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Рисунок 27. Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксиив сочетании с ингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на количество эритропоэтина в CA1 полегиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ. Маркер, 100мкм94Рисунок 28. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивныхк эритропоэтину клеток в CA1 поле гиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ.
*, Различиядостоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению кТГ, p≤0.05.Приисследованиисодержанияскорость-лимитирующегоферментапентозофосфатного пути, Г6ФДГ (Рисунок 29), нами было обнаружено уменьшениесредней оптической плотности иммунопозитивных к Г6ФДГ клеток до 84% от контролячерез 4 дня после ТГ.В свою очередь ингибирование HIF1 перед ТГ предотвращает дефицит экспрессииГ6ФДГ в СА1 поле гиппокампа (83, 122 и 116% от контроля через 1, 2 и 4 дня после ТГ,соответственно; отличия от контроля недостоверны).95Рисунок 29. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивныхк Г6ФДГ клеток в CA1 поле гиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ.
*, Различия достоверныпо отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Эти эксперименты позволили нам подтвердить ранее представленные результаты(раздел 4.01), согласно которым ТГ приводит к over-экспрессии HIF1a через 1 день послереоксигенации.
Инъекция ингибитора HIF1 вызывает долгосрочную супрессию белковогопродукта транскрипционной активности HIF1, эритропоэтина, что свидетельствует обэффективности используемого ингибитора. В то же время ингибирование HIF1непосредственно перед ТГ предотвращает уменьшение содержание Г6ФДГ, что позволяетвыдвинуть предположение, противоположное ранее (на основании результатов раздела4.01) высказанной гипотезе, согласно которому существует отрицательная регуляцияферментов ПФП гипоксия-индуцируемым факторм-1..964.02.03. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФНДля оценки функционального состояния пентозофосфатного пути в гиппокампекрыс, переживших ТГ, следующую за инъекцией ингибитора HIF1 или без нее, мыопределили активность Г6ФДГ и измерили количество восстановленного НАДФ.
Какпоказано на Рисунке 30, А, через 1 день после ТГ активность Г6ФДГ возрастает до 135% отконтроля. Однако в дальнейшем происходит снижение активности этого фермента до 65%через 4 дня реоксигенации. Параллельно этому наблюдается устойчивое уменьшениеколичества продукта пентозофосфатного пути, НАДФН (Рисунок 30, Б).
Так через 1,2 и 4дня после ТГ его количество в гиппокампе крыс составляет 38, 34 и 52% от контроля,соответственно.При этом ингибирование HIF1 вызывает сначала снижение активности Г6ФДГ через1 день после гипоксического воздействия (64% от контроля), а затем постепеннуюнормализацию активности (86 и 91% от контроля, через 2 и 4 дня после ТГ, соответственно)(Рисунок 30, А)).
Количество НАДФН как в случае ингибирования HIF1 перед ТГ, так и привведении ингибитора не подвергавшимся гипоксии крысам, значительно повышен (183, 193и 159% от контроля через 1,2 и 4 дня после ТГ и 205% от контроля через 1 день послевведения негипоксированным крысам) (Рисунок 30, Б).Рисунок 30. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на активность Г6ФДГ (А) и количество НАДФН (Б) вгиппокампе крыс.
Активность Г6ФДГ и количество НАДФН нормализованы на количествообщего белка и выражены в % от контроля. *, Различия достоверны по отношению кконтролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.97Таким образом, использование ингибитора HIF1a непосредственно перед ТГпредотвращает отсроченное уменьшение активности Г6ФДГ, а также способствуетустойчивому накоплению НАДФН, вероятно, как за счет стимуляции ПФП, так и врезультате подавления гликолиза, являющегося HIF1- зависимым метаболическим путем,конкурирующим с ПФП за субстрат (Semenza, 2001, Fernandez-Fernandez et al., 2012).Можно предположить, что повышение эффективности ПФП, вызванное ингибированиемHIF1,должноспособствоватьпредотвращениюранеевыявленногосостоянияокислительного стресса в гиппокампе крыс, переживших ТГ, а также может лежать в основенейропротективного действия ингибирования HIF1.4.02.04. Анализ окислительно-восстановительного статуса, количества общегоглутатиона и оснований ШиффаДляоценкиокислительногострессанамибылоцененокислительно-восстановительный статус цитозольной фракции гиппокампа крыс по соотношениютиоловых групп к общему содержанию белка.
Как видно из Рисунка 31, A, снижениеэффективности ПФП в гиппокампе крыс, переживших ТГ, сопровождается долгосрочнымсмещением окислительно-восстановительного статуса клеток в сторону окисленногосостояния. Так через 1, 2 и 4 дня после ТГ данный показатель составляет 75, 42 и 57% отконтроля, соответственно.
В то же время инъекция инибитора HIF1 перед ТГпредотвращает этот эффект, и на всех исследованных временых точках для данной группыне выявлено достоверных изменений редокс статуса относительно базального уровня(Рисунок 31, А).Количество общего глутатиона через 1, 2 и 4 дня после реоксигенации в гиппокампекрыс, переживших ТГ без инъекции ингибитора, составляет всего 14, 15 и 11% от контроля,соответственно, что свидетельствует о ярко выраженном окислительном стрессе (Рисунок31, Б). При этом инъекция ингибитора HIF1 перед ТГ существенно ослабляет снижениеуровня глутатиона.
В этом случае количество глутатиона составляет 59, 58 и 54% отконтроля через 1, 2 и 4 дня после ТГ, соответственно (Рисунок 31, Б).98Рисунок 31. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сингибированием HIF1 (ТГ+HIF1i) на количество тиоловых групп (А) и количествоглутатиона (Б) в гиппокампе крыс. Количество тиоловых групп и глутатионанормализованы на количество общего белка и выражены в % от контроля. *, Различиядостоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению кТГ, p≤0.05.При оценке интенсивности перекисного окисления липидов, мы использовалиоснования Шиффа в качестве маркера.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
