Диссертация (1145748), страница 15
Текст из файла (страница 15)
На Рисунке 14 представлены репрезентативные микрофотографиииммунопозитивных к Bcl-2 и BDNF клеток во втором слое сенсомоторной корыконтрольных крыс и крыс, подвергавшихся воздействию ТГ и ТГ+3ПостК.Результаты статистической обработки полученных микрофотографий показывают,что через 4 дня после ТГ наблюдается увеличение средней оптической плотностииммунопозитивных по Bcl-2 клеток во втором слое неокортекса до 376% относительноконтроля (Рисунок 15, А), в то время как у ПостК животных происходит снижение этогопоказателя относительно ТГ, однако он остается выше контрольных значений (233% отконтроля (Рисунок 15, А)).Рисунок 14.
Микрофотографии (40х) второго слоя неокортекса контрольных крыс(Контроль) (А,Г), через 4 дня после тяжелой гипоксии (ТГ+4дня) (Б,Д) и через день послетяжелой гипоксии в сочетании с трехкратным посткондиционированием умереннойгипобарической гипоксией (ТГ+3ПостК+1день) (В,Е). Иммуногистохимическая реакция наBcl-2 (А,Б,В) и BDNF (Г,Д,Е). Маркер, 100 мкм77Рисунок 15. Средняя оптическая плотность иммунопозитивных к Bcl-2 (A) и BDNF (Б)клеток во втором слое неокортекса контрольных крыс (белые столбики) и через 96 часовпосле тяжелой гипобарической гипоксии у непосткондиционированных (черные столбики)и посткондиционированных животных (серые столбики). По оси абсцисс - время послетяжелой гипоксии; по оси ординат – средняя оптическая плотность иммунопозитивныхклеток в % от контроля.
*, различия с контролем статистически достоверны, р≤0.05; #,различия статистически достоверны по сравнению с ТГ, р≤0.05.На четвертый день после воздействия ТГ наблюдается увеличение количества BDNFво втором слое неокортекса до 214,2% от контроля (Рисунок 14, Д, 15, Б). В то же времяумеренная гипоксия в режиме ПостК приводит к увеличению содержания BDNF во второмслое неокортекса, в котором средняя оптическая плотность иммунореактивных к этомубелку клеток многократно (более чем в 7 раз) превышает контрольные значения (Рисунок15, Б).Результаты проведенного исследования выявили особенности эффектов тяжелойповреждающей гипобарической гипоксии в отдаленный период и ее сочетанного действияс умеренной гипобарической гипоксией в режиме ПостК на паттерн экспрессииантиапоптотического белка Bcl-2 и проадаптивного белка BDNF в клетках сенсомоторнойкоры крыс по сравнению с гиппокампом.
В неокортексе крыс, переживших ТГ, в отличиеот гиппокампа происходит отсроченное достоверное повышение содержания белков,ответственных за механизмы выживания нейронов, нейрональную пластичность, а именнонейротрофинов (BDNF) и антапоптотических факторов (Bcl-2) в неокортексе крыс. Приэтом в ранний период (3-24 часа) после тяжелого воздействия уровень экспрессии Bcl-2 иBDNF в неокортексе либо не изменялся, либо снижался. Совокупность полученных данныхсвидетельствует о том, что отсроченная активация экспрессии Bcl-2 и BDNF, очевидно,78отражает запуск адаптивных процессов у животных, переживших ТГ, то есть носиткомпенсаторный характер и характеризует восстановительный потенциал поврежденных,но выживших нейронов неокортекса.
Тем не менее, следует отметить, что это неспособствует полной структурно-функциональной реабилитации этой структуры мозга,поскольку прогрессирующая потеря нейронов продолжается по крайней мере до 7 дней(Самойлов и др., 2015), а нарушения поведения – до 10-11 дней после ТГ (Ватаева и др.,2004). Можно предположить, что для эффективной реабилитации необходима активацияадаптационных механизмов на более ранних сроках после повреждающего воздействия.4.01.03.
Иммуногистохимический анализ содержания HIF1a и Г6ФДГСодержание регуляторной альфа субъединицы гипоксия-индуцируемого фактора-1(HIF1a) и ключевого скрость-лимитирующего фермента ПФП, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) в СА1 поле гиппокампа и втором слое сенсомоторной коры крысизучали через 1, 2 и 4 дня после ТГ и через 1 день после первого и третьего сеансов ПостКиммуногистохимическим методом.4.01.03.01. Содержание HIF1a в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортексаС применением иммуногистохимического анализа содержания регуляторной альфасубъединицы HIF1, HIF1а, в СА1 поле гиппокампа (Рисунок 16, А, 17, А) нами былопоказано, что через 1 день после ТГ происходит увеличение средней оптической плотностииммунопозитивных к HIF1а клеток до 377% от контроля, после чего средняя оптическаяплотность иммунопозитивных клеток снижается, составляя через 2 дня послереоксигенации 44%, а через 4 дня – 66% от контроля.В неокортексе выявлена противоположная динамика (Рисунок 16, Б, 17, Б): через 1деньреоксигенациипроисходитуменьшениесреднейоптическойплотностииммунопозитивных к HIF1a клеток до 55% от контроля, а в дальнейшем уровень HIF1aпостепенно нормализуется, составляя через 2 дня после ТГ 79%, а через 4 дня – 102% отконтроля.В случае предъявления после ТГ гипоксического ПостК динамика HIF1 вгиппокампе существенно меняется (Рисунок 16, А, 17, А), а именно происходитнормализация уровня этого транскрипционного фактора через 2 дня после ТГ (115% отконтроля) и up-регуляция через 4 дня (293% от контроля).79В неокортексе не выявлено изменений в динамике HIF1a в результате ПостК посравнению с ТГ – средняя оптическая плотность иммунопозитивных к HIF1a клеток во 2мслое сенсомоторной коры крыс этой группы составила 81% и 131% от контроля, через 2 и4 дня после ТГ, соответственно.Рисунок 16.
Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксиив сочетании с гипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на количество HIF1a вCA1 поле гиппокампа (А) и втором слое неокортекса (Б) через 1,2 и 4 дня после ТГ. Маркер,100мкм80Рисунок 17. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сгипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на среднюю оптическую плотностьиммунопозитивных к HIF1a клеток в CA1 поле гиппокампа (А) и втором слое неокортекса(Б) через 1,2 и 4 дня после ТГ. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05;#, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Таким образом результаты этой серии экспериментов указывают на краткосрочнуюгиперактивациюHIF1aвгиппокампеикраткосрочнуюсупрессиюданноготранскрипционного фактора в неокортексе крыс, переживших ТГ, что, как было показаноранее, сопровождается массированной гибелью нейронов гиппокампа и менее выраженнойпотерей нейронов неокортекса через 7 дней после воздействия (Rybnikova et al., 2012).
В тоже время предъявление ПостК пережившим ТГ крысам способствует стабилизации споследующей up-регуляцией HIF1a в СА1 поле гиппокампа после третьего сеанса УГГ, неоказывая эффекта на его уровень во втором слое сенсомоторной коры, где ТГиндуцированное краткосрочное снижение экспрессии HIF1a нивелируется ко второму днюпосле воздействия вне зависимости от предъявления ПостК.Учитывая тот факт, что методом электрофоретического анализа фрагментации ДНКустановлено противоапоптотическое действие ПостК в гиппокампе крыс уже после первогосеанса УГГ, когда уровень HIF1a не отличается от контрольного, а также принимая вовнимание различную степень выраженности апоптотических процессов в гиппокампе, гдепроисходит краткосрочная стимуляция содержания HIF1a в ответ на ТГ, и неокортексекрыс, где наблюдается краткосрочная супрессия этого транскрипционного фактора наранних сроках реоксигенации, можно предположить, что HIF1, ключевой регуляторадаптивных реакций на хроническую гипоксию, в условиях острой гипоксии с81последующей реоксигенацией способен вовлекаться в реализацию не столько адаптивных,сколько патологических эффектов ТГ.4.01.03.02.
Содержание Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортексаПри исследовании содержания скорость-лимитирующего фермента ПФП, Г6ФДГ, вСА1 поле гиппокампа (Рисунок 18, А), мы выявили отсроченное уменьшение среднейоптической плотности иммунопозитивных к Г6ФДГ клеток до 84% от контроля через 4 дняпосле реоксигенации. При этом в неокортексе происходит уменьшение количества Г6ФДГко второму дню после ТГ (62% от контроля) и нормализация через 4 дня (96% от контроля)(Рисунок 18, Б).ПостК предотвращает отсроченное снижение количества Г6ФДГ в СА1 полегиппокампа (Рисунок 18, А), не влияя на динамику экспрессии этого белка в неокортексе(Рисунок 18, Б).Рисунок 18.
Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сгипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на среднюю оптическую плотностьиммунопозитивных к Г6ФДГ клеток в CA1 поле гиппокампа (А) и втором слое неокортекса(Б) через 1,2 и 4 дня после ТГ. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05;#, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.824.01.04. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФНДля оценки функционального состояния ПФП в гиппокампе и неокортексе крыс,переживших ТГ или ТГ в сочетании с ПостК, мы определили активность Г6ФДГ и измериликоличество восстановленного НАДФ.
Как видно на Рисунке 19, А, через 1 день после ТГактивность Г6ФДГ в гиппокампе возрастает до 135% от контроля. Однако в дальнейшемпроисходит снижение активности этого фермента до 65% через 4 дня после тяжелогогипоксического воздействия. Параллельно этому наблюдается устойчивое уменьшениеколичества продукта ПФП, НАДФН (Рисунок 19, Б)).
Так через 1,2 и 4 дня после ТГ егоколичество в гиппокампе крыс составляет 38, 34 и 52% от контроля, соответственно. Приэтом трехкратное ПостК предотвращает снижение активности Г6ФДГ в гиппокампе через4 дня после ТГ (114% от контроля) (Рисунок 19, А), вызывая постепенную нормализациюколичества НАДФН (62% и 105% от контроля через 2 и 4 дня после ТГ, соответственно)(Рисунок 19, Б).Рисунок 19. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании сгипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на активность Г6ФДГ (А,В) иколичество НАДФН (Б,Г) в гиппокампе (А,Б) и неокортексе (В,Г) крыс.
Активность Г6ФДГи количество НАДФН нормализованы на количество общего белка и выражены в % от83контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различиядостоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.В неокортексе крыс, переживших ТГ, через 1 и 4 дня реоксигенации не выявленодостоверных изменений активности Г6ФДГ по сравнению с контролем (87% и 89% отконтроля через 1 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 19, В). Однако через 2 дняпосле ТГ, аналогично данным по количеству Г6ФДГ, наблюдается небольшое уменьшениеактивности Г6ФДГ (74% от контроля). Количество НАДФН в неокортексе крыс былоснижено в течение двух дней после ТГ (46% и 76% от контроля через 1 и 2 дня после ТГ,соответственно), не отличаясь достоверно от нормального уровня через 4 дня после ТГ(89% от контроля) (Рисунок 19, Г).ПостК предотвращает снижение активности Г6ФДГ через 2 дня после ТГ (109% и108% от контроля через 2 и 4 дня после ТГ, соответственно) (Рисунок 19, В), нормализуяколичество НАДФН уже через 2 дня после ТГ (101% и 102% от контроля через 2 и 4 дняпосле ТГ, соответственно) (Рисунок 19, Г).Пентозофосфатный путь безусловно является одним из важнейших элементовметаболизма мозга, в частности благодаря генерации восстановленного НАДФН,вовлеченного в процессы синтеза макромолекул, поддержание антиоксидантных систем иобеспечение нормального окислительно-восстановительного статуса (Fernandez-Fernandezet al., 2012, Ben-Yoseph et al., 1996).
Так недавно была показана существенная роль ПФП впредотвращении последствий окислительного стресса, индуцированного депривациейкислорода и глюкозы in vitro (Sun et al., 2017), а in vivo получены сведения, указывающиена перспективность использования продукта ПФП, НАДФН, при ранней терапиипостинсультных состояний (Li et al., 2017).В данной работе нами выявлена сходная динамика содержания и активностиключевого фермента ПФП, Г6ФДГ и экспрессии HIF1a в гиппокампе и неокортексе крыс,переживших ТГ с и без последующих сеансов ПостК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
