Диссертация (1145748), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Приготовление: компонент А (авидин) добавляли в фосфатный буфер (разведение1:100) перемешивали; добавляли компонент В (биотин) в смесь (разведение 1:100),перемешивали. Реактив АВС готовили за 30 мин до использования.7)Диаминобензидиновый набор (DAB substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories,Inc, USA), содержащий следующие компоненты буфер, 3,3-диаминобензидин, Н2О2 (30%),используемые в пропорции 50:100:50 мкл, соответственно, на 2.5 мл Н2О.Эксперименты проводились по следующему протоколу:После депарафинизации срезы отмывали в фосфатном буфере и осуществлялидемаскировку антигена кипячением в цитратном буфере под давлением в течение 1 мин.Затем отмывали срезы в фосфатном буфере 2 раза по 5 мин.
и обрисовывали гидрофобныммаркером, предотвращающим раcтекание реактива. Далее блокировали неспецифическоесвязывание. Для этого на срез наносили нормальную сыворотку и оставляли на 30 мин прикомнатной температуре. Жидкость добавляли по каплям из расчета 40 мкл раствора на срез.Затем препараты в течение ночи инкубировали с первичными поликлональными54кроличьими антителами к исследуемым белкам (Bcl-2, BDNF, HIF1a, эритропоэтин,Г6ФДГ) во влажной камере при температуре +4°C. После инкубации стекла отмывали вфосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Затем обрабатывали срезы вторичнымибиотинилированными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре во влажнойкамере и отмывали в фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Далее наносили растворуниверсальной системы авидин-биотинового комплекса (реактив № 6) и инкубировали 30мин при комнатной температуре.
После инкубации с АВС-комплексом образцы промывалив фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Для визуализации реакции связывания антитела сантигеном использовали диаминобензидиновый набор. Раствор готовили ex tempore инаносили на срезы для выявления иммунопозитивной реакции, после чего препаратыотмывали в дистиллированной воде (3 раза по 5 мин), сушили на воздухе и заключали подпокровное стекло в глицерин-желатиновый гель (1:1).3.04.02.02. Количественная обработка результатов иммуногистохимическогоокрашивания с использованием системы компьютерного анализа изображенийАнализпрепаратовпроводилиспомощьюморфометрическойустановки,позволяющей осуществить косвенную оценку изменения количества исследуемых белковпо средней оптической плотности (интенсивности окраски) иммунопозитивных клетокотносительно фона (Рисунок 9).
Морфометрическая установка состояла из световогомикроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровой камеры Baumer CX05c (BaumerOptronic, Germany) и компьютера IBM PC с программным обеспечением ВидеоТест МастерМорфология (разработка ООО “Видео Тест”, Санкт-Петербург). Используя программуВидеоТест Мастер Морфология, определяли среднюю оптическую плотность клетокотносительно фона.
Анализировали иммунопозитивные клетки в поле зрения площадью460х340 мкм (объектив 40х). Для каждого животного анализировали по 6 гистологическихпрепаратов, усредняя значения для каждой области мозга c одного поля зрения конкретнойобласти мозга на срезе. Результаты обрабатывали с помощью пакетов анализа данныхSTATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel’2003, использовали непараметрическийкритерий Манн-Уитни (Mann-Whitney U-test). Изменения считали достоверными приp≤0,05. Все результаты представлены в виде среднего арифметического ± SEM (standarderror of the mean) и выражены в процентах от контроля.55Рисунок 9.Пример результата автоматического анализа изображения среза поля СА1гиппокампа с использованием программы ВидеоТест Мастер Морфология.3.04.03. Детекция апоптотических клеток методом TUNELКоличество нейронов, подверженных апоптотическим процессам, оценивали в CA1поле гиппокампа и втором слое неокортекса крыс через 4 дня после ТГили,соответственно, через 1 день после третьего сеанса посткондиционирования.
dUTPконцевое мечение ДНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (Terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL) проводили на парафиновыхсрезах (7 мкм) мозга крыс с использованием коммерческого набора NeuroTACs (R&DSystems, Великобритания), визуализируя фрагментацию ДНК, специфичную для апоптоза.После депарафинизации срезы мозга инкубировали с реагентом NeuroPore в течение60 минут при комнатной температуре.
После промывки срезов в PBS их погружали вреакционную смесь, содержащую TdT и биотинилированные нуклеотиды, и инкубировалив течение 1 часа при +370С. Реакцию останавливали посредством инкубации в TdT StopBuffer. После трех промывок в PBS секцию инкубировали с коньюгатом стрептавидина ипероксидазы хренавтечение10минприкомнатнойтемпературе.Реакцию56визуализировали диаминобензидином. Далее срезы были подкрашены Blue Counterstain длявизуализации всех клеток, и секции были высушены на воздухе, смонтированы ипроанализированы с использованием системы анализа изображений.Число TUNEL-положительных клеток подсчитывали в поле CA1 гиппокампа ивтором слое сенсомоторной коры, используя программное обеспечение Видеотест MasterMorphology. Из каждого мозга анализировали четыре среза; одно поле каждой исследуемойобласти мозга измерялось на каждый срез.3.05.
ИммуноблоттингДля проверки специфичности используемых при иммуногистохимическом анализеантителиспользовалиметодиммуноблоттинг,позволяющимсравнитьмассувизуализируемых белков с массой белка интереса и сделать вывод о специфичностиреакции.3.05.01. ПробоподготовкаКрыс декапитировали и быстро на холоде извлекали мозг. Чтобы исключитьдействие протеаз, извлеченный мозг незамедлительно замораживали при температуре -80°С, и дальнейшее выделение интересующих областей вели при отрицательной температурена замораживающем столике. Для одной пробы выделяли участок гиппокампа инеокортекса примерно по 30 мг и гомогенизировали в лизирующем буфере (0,05М трисHCl (pH8), 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, 1%, 0,001М дитиотриэтол, 0,01М NaF, 0,01MNa3VO4, каждый из компонентов протеазингибирующего коктейля Proteas Inhibitor CoctailKit (MP Biomedicals, USA) – AEBSF, ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия, леупептин,пепстатин А (разведение 1:40)).Гомогенизацию вели в стеклянных гомогенизаторах на ледяной бане в 300 мкллизирующего буфера, далее осуществляли экстракцию белков при +4°C в течение 20 мин,периодически перемешивая.
Переносили в пробирки для центрифугирования и смывалиостатки ещё двумя порциями буфера по 300 мкл. Ценрифугировали полученный лизат науравновешенной центрифуге Microfuge в течение 25 мин при 15000g. Аккуратно отбиралинадосадочную жидкость в новую пробирку. После центрифугирования отбиралисупернатант и кипятили на водяной бане с трехкратным объемом буфера нанесения(0,0625М трис-HCl (pH6,8), 2%SDS, 25% глицерин, 0,01% бромфенол синий, 5% бета-57меркаптоэтанол) в отношении 2:1 в течение 5 мин, далее быстро охлаждали во льду. Послерасфасовки пробы хранили при -20ºС, не размораживая вплоть до использования приэлектрофоретическом разделении.
Параллельно отбирали 2 аликвоты супернатанта по 6мкл для определения концентрации белка методом Бредфорда в стеклянные пробирки, вкоторых предварительно наливали по 1 мл дистиллированной воды.3.05.02. Определение концентрации белка по методу БредфордаМетод Бредфорда основан на взаимодействии белка с кислым красителем КумассиG-250.Концентрацияобразующегосяокрашенногокомплексапропорциональнаконцентрации белка в пробе. Поглощение раствора измеряли спектрофотометрически придлине волны 590 нм против соответствующего контроля.
Общую концентрацию белков вкаждой пробе необходимо знать для того, чтобы при проведении электрофоретическогоразделения в каждую дорожку наносить эквивалентные количества белка.Для колориметрического анализа использовали реактив Кумасси – 6% красительКумасси G-250 в 3% надхлорной кислоте. Для расчёта концентрации белка в исследуемойпробе 6 мкл пробы растворяли в 1 мл воды, добавляли 1 мл реактива Кумасси иперемешивали. Через 20 мин измеряли поглощение при длине волны 590 нм противсоответствующего контроля (1 мл воды + 1 мл реактива).
Каждую пробу измеряли в двухповторностях. Концентрацию белка в пробе рассчитывали по калибровочному графику иучитывали при определении объема пробы, который будет использован для электрофореза.Для построения калибровочной кривой использовали стандартный раствор белка – BSA.Затем прибавляли 1 мл реактива Кумасси и перемешивали.3.05.03.
Электрофорез белков в ПААГ по методу ЛэммлиПодготовленные экстракты нервных клеток, содержащие белки интереса, разделялиэлектрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) - система Лэммли, на трисглициновом буфере (pH 8.3) в присутствии 0.1% SDS. Электрофорез проводили в камереMini-PROTEAN®4 Cell (Bio-Rad, USA). Приготовление ПААГ и других необходимыхрастворов осуществляли согласно рекомендации фирм Bio-Rad и Abcam. Трис-глициновыйбуфер для электрофореза (pH~8,3) готовили из стокового 10-кратного раствора (15,15 гтриса, 72 г глицина, 5 г SDS, бидист. вода до 500 мл) разведением в 10 раз. При нанесениипроб на ПААГ, учитывали рассчитанную общую концентрацию белка в пробе, чтобы было58нанесено одинаковое количество белка.
В качестве маркеров молекулярной массыиспользовали окрашенные белки-стандарты ColorPlus (BioLabs, USA). Электрофорезпроводили при 160 v - концентрирование, 5 мин, и далее разделение I = 30мА на 1 гель, U= 200 V в течение 35 мин.В некоторых случаях для контроля качества разделения белков электрофорезом(если гель не использовался далее для блоттинга) и для контроля качества переноса белковиз ПААГ на мембрану (после блоттинга) проводили визуализацию результатовэлектрофореза в геле, для чего белки окрашивали 0,1%-ным красителем Кумасси G-250 втечение 30 мин.
После окрашивания гель отмывали от несвязавшегося красителя 5%-нойуксусной кислотой с этанолом (все процедуры проводили на шейкере).3.05.04. Электроперенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрануРазделенные электрофоретически белки переносили на нитроцеллюлознуюмембрану, используя, как и для электрофореза, аппарат Mini-PROTEAN, но в модификациидля блоттинга. Для последующего переноса разделяющий ПААГ, содержащий белки,вымачивали в охлажденном буфере для переноса (25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,3) втечение 30 мин, смачивали этим же буфером фильтры Ватман и нитроцеллюлознуюмембрану Protran BA85 (Whatman, Germany), выкладывали их последовательно на кассетедля блоттинга, плотно совместив ПААГ и мембрану, вставляли кассету в камеру, и, заливбуфером, запускали блоттинг. Электроперенос вели в течение 1 – 1,5 часов при силе тока I= 1мА на см2 мембраны (100 – 150 V, 350 mA) при постоянном перемешивании иохлаждении.О полноте переноса судили по переносу предварительно окрашенных белковстандартов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
