Диссертация (1145638), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Среди них наиболее частовстречаются нарушения фертильности самцов и дефекты нервной системы (FlyBase1, 2017).Мутации, затрагивающие нервную систему, нарушают: долговременную память (Никитина идр. 2003, 2003б) формирование моторных нейронов в эмбриогенезе (Korey et al., 2001), брачноеповедение у самцов (Касаткина, 2007; Ацапкина и др., 2010). Полифункциональность гена исуществование аллель-специфичных фенотипов могут отражать эволюционные события, врезультате которых были объединенины несколько элементарных функций, что и привело квозникновению нового гена (Long et al., 2003). В этом случае различные мутации могутнарушать отдельные функции гена, не затрагивая остальные.
Исследование явленияплейотропии имеет важное значение для медицины, поскольку в перспективе позволяетразработать терапию наследственных заболеваний, вызванных мутациями в таких генах. Важнопонять, существует ли возможность направленно воздействовать на одни функции гена, незатрагивая остальные.У млекопитающих, включая человека, специализированные функции в нервной системевыполняют, в основном, паралоги гена nxf1.
В медицинской практике известны пациенты с1http://flybase.org9серьезнымидефектамиразвитиямозгаиумственнойотсталостью,вызванными,предположительно, потерей функции гена Hs nxf5 (Frints et al., 2003; Grillo et al., 2010). У рядапациентов с аутизмом выявлены мутации в гене Hs nxf5, приводящие к потере материалаодного из экзонов, в результате чего белок NXF5 оказывается укороченным на 27 аминокислот(Piton et al., 2013). Белок NXF5 преимущественно локализуется в цитоплазме в теле и отросткахнейронов (Jun et al., 2001). Исследователи полагают, что белок NXF5 избирательнообеспечивает транспорт и/или локализацию определенных нейроспецифичных транскриптов, апотеря функции этого белка у человека приводит к нарушению развития и функционированияголовного мозга (Jun et al., 2001; Grillo et al., 2010).
Функциональным аналогом белка NXF5человека является белок NXF7 мыши, который присутствует в цитоплазме нервных клеток(Vanmarsenilleetal.,2013;Callaerts-Veghetal.,2015).Специализированныецитоплазматические функции в нервной системе характерны и для белков NXF2 грызунов(Tretyakova et al., 2005; Takano et al., 2007; Katahira et al., 2008). В последнее время появляетсявсё больше данных, свидетельствующих о существовании специализированной функции внервной системе у альтернативного продукта гена nxf1 – короткого белка sNXF1.
Умлекопитающих этот белок является продуктом трансляции альтернативного транскрипта генаnxf1, образованного за счет сохранения интрона 10 (Wang et al., 2015; Li et al., 2016). Полагают,что короткий белок sNXF1 может взаимодействовать с полноразмерным белком NXF1, и такойкомплекс приобретает способность специфично взаимодействовать с определёнными мРНК (Liet al., 2016).Для паралогов гена sbr (Dm nxf1) у дрозофилы специализированные функции в нервнойсистеме не показаны.
Есть основания полагать, что ген sbr является многофункциональным, испециализированныецитоплазматическиефункциивнервнойсистемевыполняютальтернативные продукты этого гена (Ivankova et al., 2010). Из-за сходства доменной структурыбелков семейства NXF, закономерности, выявленные для изоформ белка SBR (Dm NXF1)дрозофилы, могут быть распространены и на белки этого семейства у млекопитающих. Вформировании и функционировании мозга дрозофилы задействованы те же эволюционноконсервативные процессы, что и у млекопитающих, поэтому исследование механизмовреализации специализированной функции гена sbr в нервной системе на модельном объекте –D. melanogaster – поможет понять роль генов семейства nxf в развитии и функционированиинервной системы у представителей различных таксонов, включая человека.Изучение специализированныхных функций гена sbr у дрозофилы расширяет нашизнания о роли белков семейства NXF в развитии и функционировании организмов.Использование D.
melanogaster в качестве модельного объекта очень важно, посколькупозволяет изучить альтернативные функции генов семейства nxf на организменном уровне, что10невозможно сделать на культуре клеток. При формировании многоклеточного организмареализация генетической информации происходит в соответствии с конкретными программамиразвития, и регулируется на различных уровнях в зависимости от органа, ткани или периодаонтогенеза. Выявленные специализированные функции, присущие как конститутивному, так иальтернативным продуктам гена sbr, открывают новые перспективы в процессах регуляцииформирования и функционирования различных органов и систем.Степень разработанности темы исследованияНейрогенез – это эволюционно-консервативный процесс, начиная от генетическогоконтроля спецификации нейробластов и их потомков (Egger et al., 2008; Li et al., 2013a), дорегуляции формирования нейронных сетей и оптимизации коннектома (Sanchez-Soriano et al.,2007; Araujo, 2015; Yamaguchi and Miura, 2015a; Menon and Gupton, 2016).
Согласованнаяреализация генетических программ развития, определяющих формирование многообразиятипов нейронов и установку корректных связей между ними, в конечном итоге, приводит кформированию полноценно функционирующего мозга. Поэтому, изучение этих процессоввозможно с использованием хорошо изученных модельных объектов, а данные, полученные втаких исследованиях, могут быть экстраполированы на более сложно устроенные организмы,включая человека. Дрозофила является хорошо разработанным модельным объектом дляизучения развития и функционирования нервной системы (Sanchez-Soriano et al., 2007).
Каждыйнейробластуникален:имеетжесткодетерминированноевремяиместопоявления,характеризуется уникальным набором генетических маркеров и продуцирует установленноеколичество потомков определённого типа (Doe, 1992; Urbach and Technau, 2003). Это позволяетпроследить судьбу клетки от момента появления нейробласта до формирования зрелойнейронной сети.
Хорошо изучен процесс дифференцировки нейронов, сопровождающийсяростом аксонов и их нацеливанием на свои мишени, а также процесс оптимизации коннектома,обеспечивающий корректное функционирование мозга (Yamaguchi and Miura, 2015a, b; Menonand Gupton, 2016).Динамичные изменения цитоскелета и локализованная трансляция мРНК имеюткритическое значение для нейрогенеза, формируя позиционную информацию в развивающемсямозге и определяя рост отростков нервных клеток и формирование корректных связей междунейронами (Sanchez-Soriano et al., 2007; Menon and Gupton, 2016).
Нарушение функции многихбелков, ассоциированных с цитоскелетом, в том числе РНК-связывающих белков, частоприводит к возникновению дефектов формирования и функционирования мозга (Boquet et al.,2000a; Van Vactor et al., 1993; Dent et al., 2011).Для ряда генов семейства NXF показаны нейроспецифичные функции, среди которых –взаимодействие с белками, ассоциированными с цитоскелетом (Tretyakova et al., 2005; Takano et11al., 2007; Katahira et al., 2008) и сохранение связи в цитоплазме с определенными мРНКмишенями (Zhang et al., 2007; Wang et al., 2015).
Существование мутаций в гене sbr удрозофилы, имеющих доминантно-негативное проявление в нервной системе, поднимаетвопрос о механизмах реализации этих эффектов. Совокупность ранее полученных данныхпозволяет предполагать, что у D. melanogaster существование альтернативных продуктов генаsbr (Dm nxf1) формирует потенциал для выполнения специальзированных функций, важных дляформированиянервнойсистемыи,по-видимому,связанныхсцитоскелетомицитоплазматическим транспортом определённых мРНК.Цель данной работы – исследовать роль гена sbr в развитии и функционировании мозгау D. melanogasterЗадачи:изучить влияние дозы гена sbr, присутствия аллеля sbr12, а также хромосомойлокализации аллеля sbr+ на активность самцов и самок D.
melanogaster в тесте наотрицательный геотаксис в зависимости от возраста;исследовать структуру мозга на стадиях личинки третьего возраста и имаго у самцов исамок D. melanogaster различных генотипов;исследовать причину структурных дефектов медуллы у самцов-носителей аллеля sbr12,имеющих явные нарушения поведения;определить характер локализации белка SBR в мозге D. melanogaster в динамикеличиночного развития;сравнить характер локализации белка SBR в нейронах с распределением белка dFMR1,который является компонентом транспортных РНП-гранул.Научная новизнаУстановлено, что полноразмерный белок SBR (Dm NXF1) присутствует в виде гранул вотростках нейронов, а также имеет зональное распределение в ткани мозга, маркируяопределенные нейробласты и их потомков в личиночном периоде развития.
Такой характерлокализации отражает наличие у белка SBR альтернативных цитоплазматических функций внервной системе, отличных от универсального ядерно-цитоплазматического экспорта мРНК.Впервые показано, что нарушение поведения и способности к отрицательномугеотаксису у самцов, несущих аллель sbr12 в гетерозиготе, ассоциировано с дефектамиформирования некоторых функциональных центров мозга: эллипсоидного тела и медуллы, атакже с увеличением уровня нейродегенерации. У самок фенотипическое проявлениеприсутствия аллеля sbr12 в гетерозиготе выражено слабее и проявляется с возрастом.12Впервые установлено, что дефекты формирования медуллы у самцов, несущих аллельsbr12 в гетерозиготе, связаны с нарушением роста и терминации аксонов фоторецепторов исопровождается повышенным уровнем нейродегенерации уже на личиночной стадии развития.Теоретическая и практическая значимостьИзучение специализированных функций эволюционно-консервативного гена nxf1 уD.
melanogaster имеет фундаментальное значение, поскольку вносит вклад в представление обособенностях тканеспецифичной регуляции экспрессии генов на посттранскрипционномуровне, ставит вопрос о роли альтернативных продуктов гена nxf1 в формировании ифункционировании нервной системы, а также демонстрирует связь между процессамитранскрипции, экспорта и трансляции мРНК, опосредованную РНК-связывающими белками,участвующими в этих процессах. Полученные в работе результаты способствуют пониманиюмеханизмов, лежащих в основе формирования дефектов структуры мозга и поведения. НаличиеспециализированныхфункцийвнервнойсистемеуполноразмерногобелкаSBR,обеспечивающего глобальный экспорт большинства мРНК из ядра в цитоплазму, наряду ссуществованием короткого белка SBR-ir – продукта трансляции транскрипта с невырезанныминтроном 5, иллюстрирует сходство перехода от универсальной к специализированнойфункции альтернативных продуктов одного гена у различных организмов: в нервной системе умлекопитающихтоже присутствует транскрипт с сохранённым интроном 10 (этот интронгомологичен интрону 5 гена sbr дрозофилы), транслирующийся в короткий белок sNXF1,способный взаимодействовать с полноразмерным белком NXF1, предположительно, длясвязывания определенных мРНК.
В то же время, наличие специализированных функций у белкаSBR свидетельствуют об эволюционном многообразии путей реализации аналогичных задач намолекулярном уровне в семействах генов млекопитающих и дрозофилы.Все описанные закономерности могут быть использованы в качестве иллюстративногоматериала в соответствующих по тематике образовательных курсах .Методология и методы исследованияВ работе использованы следующие методы и подходы: культивирование линийD.
melanogaster,получениеособейнужныхгенотипов путёмпостановкигибридныхскрещиваний; препарирование органов на различных стадиях развития (мозг личинок первоговозраста, глазо-антеннальные имагинальные диски и мозг личинок третьего возраста, мозгимаго); иммуногистохимическая окраска органов; приготовление парафиновых срезов головимаго, окрашенных гематоксилином-эозином; анализ препаратов при помощи световой илазерной сканирующей конфокальной микроскопии; методы статистического анализа.Личный вклад диссертанта13Соискателем была выполнена основная часть работ и экспериментов, представленных вдиссертационной работе: получены гибриды нужного генотипа путём скрещивания самцов исамок из имеющихся линий; проведены эксперименты по оценке активности особей в тесте наотрицательный геотаксис; препарированы и иммуногистохимически окрашены органыD.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
