Диссертация (1144820), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Большие успехи в данной области принадлежит отечественнымученым под руководством академика Н.А. Колчанова. Ими разрабатываютсяразличные генные сети, в том числе генные сети ССЗ, связанные сметаболизмом липидов (Колчанов и др., 2008).Важно отметить, что большое число генов в реконструированных сетяхподтверждает мультифакторную природу заболевания и создаёт основу дляконструирования биоинформатических моделей с целью поиска новых генов,вовлеченных в патологический процесс. Эти методы позволяют выявитьнаиболее вероятных кандидатов, которые могут бытьвключены вассоциативные сети.1.2.8. Системно-генетический подход.В современной молекулярной медицине, базирующейся на прочномфундаментеметодовмолекулярно-генетическогоанализа,всешире56используетсясистемно–генетический поход(Baranov, 2009;Баранов,Баранова, 2012).
Данный подход заключается во всестороннем анализепричин заболевания на всех уровнях: ДНК, РНК, белков, клеток, организма.Он подразумевает комплексное изучение генов – кандидатов, включающееих идентификацию, анализ экспрессии на уровне транскриптома, эпигенома,протеома и метаболома, выяснение на этой основе как изменения геноввлияют на работу отдельной клетки ткани и органа, как эти измененияреализуются в клинических проявлениях МФЗ (Афонников, Миронова, 2014,Баранов, 2016; Baranov et al., 2015, 2016).
Системно-генетический подходимеет большую перспективу, однако его развитие тесно сопряжено ссовершенствованием статистических методов обработки данных и новымиинформационными ресурсами (Афонников, Миронова, 2014).1.2.9. Заключение.Длякартированияиидентификациигенов-кандидатовМФЗиспользуют разные подходы. Каждый из них имеет свои преимущества инедостатки, свои разрешающие возможности.
Наиболее информативным внастоящеевремяявляетсяметодполногеномногосеквенирования.Применение нескольких разных подходов к картированию генов и анализуих экспрессии имеет важные преимущества и представляет особеннобольшой интерес для фундаментальной науки и практической медицины.Такой комплексный поход с учетом возможностей системной генетикиоткрываетбольшиеперспективыдляуспешногоразвитияперсонализированной предиктивной медицины.1.3.Методы детекции мутаций.Методы поиска и идентификации мутаций (ДНК-полиморфизма)изложены во многих отечественных руководствах и сборниках помолекулярной генетике (Баранов, Горбунова, 1997; Баранов и др.
2005;Иващенкоидр.2013).Основубольшинстваметодовсоставляет57полимеразная цепная реакция (ПЦР), открытие которой принесло ее автору,американскому ученому Кэрри Муллису, Нобелевскую премию 1992 г.Как правило, ПЦР сочетается с различными методами детекциимутаций.Кнаиболеераспространеннымсистемамгенетическоготестирования можно отнести следующие классические методы:1) полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP),2) аллель-специфичная ПЦР,3) ПЦР в реальном времени,Более новые методы детекции мутаций, в т.ч. и генетическогополиморфизма:1) денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения(DHPLC),2) метод поверхностного плазмонового резонанса (SPR),3) метод масс-спектрометрии,4) методы ДНК-чипов,5) технология микрочипов на основе микросфер,6) секвенирование.Технологии DHPLC, SPR и масс-спектрометрии подробно описаны всоответствующих руководствах (Иващенко и др., 2013) и сравнительно редкоиспользуютсявотечественныхлабораториях.Значительнобольшуюпопулярность и диагностическую значимость имеют методы ДНК-чипов.Также методы разделяются на те, которые применяются для детекцииизвестных мутаций, и те, которые направлены на поиск ранее неизвестныхмутаций (Баранов, 2009).
Большинство методов относятся к методамдетекции известных мутаций. Наиболее эффективные современные методыпоиска неизвестных мутаций представляют собой различные вариантысеквенирования ДНК, прежде всего, секвенирование следующего поколения(п.1.3.3).581.3.1. ДНК-биочипы.1.3.1.1. Типы биочипов.Технологиябиологическихмикрочипов,предложеннаяиразработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардтаакадемиком А.Д. Мирзабековым и его сотрудниками, явилась важнойинновацией в молекулярной биологии.
Данная технология позволяетиспользовать сравнительно небольшие количества исходного материала,проводитьреакциювнанообъемах,одновременноосуществлятьмногопараметрический анализ множества генов. Ее чувствительностьсопоставима со стандартными ПЦР методами используемых для ДНКдиагностики и в некоторых случаях превосходит их (Колчинский, 2004).В классическом исполнении биочиповый метод основан на проведениимультиплексной или моноплексной ПЦР с последующей гибридизациейфлуоресцентно-меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе,содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов(Маркелов, 2008), а также процедуры регистрации и интерпретациирезультатов (рис. 5).Несмотря на то, что технология биочипов за последние десять летпревратились в бурно развивающееся прикладное направление и десяткифирм разрабатывают и предлагают биологические микрочипы, содержащиемассивы от несколько десятков до сотен тысяч и более ДНК-зондов(«Affymetrix», «Illumina») (Lamy et al., 2011), сохраняется «дефицит»отечественных «целевых» микрочипов для исследования и диагносткиширокого спектра полиморфных маркеров в генах «предрасположенности» кМФЗ и детекции мутаций при диагностике наследственных болезней.59Рисунок 5.
Основные стадии анализа с применением биологическихмикрочипов (Маркелов, 2008).1.3.1.2. Биочипы «низкой плотности».Особое значение для клинической практики имеют биочипы «низкойплотности», которые позволяют с высокой точностью определять изменениягенотипа (Глотов и др., 2005).Такие биологические микрочипы могут быть двух вариантов:двумерные (взаимодействие между биозондами и целевыми биообъектамипроисходит в монослое носителя) и трехмерные (специфические комплексыобразуются преимущественно в порах носителя (Kolchinsky, Mirzabekov,2001; Nasedkina et al., 2002, 2006; Favis et al., 2000; Landi et al., 2003;Колчинский и др., 2005; Sinitsyna et al., 2009; Rober et al., 2009).60Трехмерные гелевые биочипы представлены двумя отечественнымиразработками: гелевыми биочипами Института молекулярной биологии РАН(схема биочипа и его изготовление приведены на рис.
6) и микрочипами наоснове «полимерных слоев» Института высокомолекулярных соединенийРАН (Kolchinsky, Mirzabekov, 2001; Nasedkina et al., 2002, 2006; Колчинскийи др., 2005; Sinitsyna et al., 2009; Rober et al., 2009).Рисунок6.иммобилизованнымиЭтапыизготовлениязондовымиисхемамакромолекулами.биочипаЭлементсбиочипа,содержащий индивидуальные зонды указан стрелкой (http://www.biochip.ru).Несмотря на то, что эти технологии существенно отличаются (вгелевых биочипах, реакционными ячейками служат сами гелевые капли, вкоторые помещают олигонуклеотидные зонды, раздельно нанесенные наподложку (Sorokin et al., 2006; Pan’kov et al., 2009), принцип детекции ДНКполиморфизмаунихобщийипредполагаетпредварительную61мультиплекснуюиспользованиемамплификациюфлуоресцентноисследуемыхмеченныхфрагментовпраймеров.ВДНКсрезультатедобавления избытка «меченного» праймера и 2-х раундов ПЦР достигаетсяобразование большого количества меченного одноцепочечного продукта.Этотпродуктдобавляютнабиочип,гдеонгибридизуетсясиммобилизованными в геле олигонуклеотидными зондами (см.
рис. 6, 7).Еслипоследовательностькомплементарнатаковойзонда,анализируемойДНКобразуетсястабильныйполностьюдуплекс(детектируют сигнал флуоресценции). Если искомого фрагмента нет, или жев нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса необразуется (сигнала флуоресценции нет) (рис. 7). Данные метод позволяетанализировать до 50 аллельных вариантов с точностью более 98% (Nasedkinaet al., 2002, 2006).5’3’GГибридизация одноцепочечногомеченного продуктас иммобилизованными на биочипеолигонуклеотидамиNNNNNNNNA NNNNNNNNNNNNNNNN C NNNNNNNNилиNNNNNNNN G NNNNNNNNNNNNNNNN C NNNNNNNN_____NNNNNNNN C NNNNNNNNДетекция флуоресцентного сигнала ианализ полученного изображенияСигналфлуоресценцииРисунок7.АнализмутацийОтсутствиефлуоресценцииметодомаллель-специфичнойгибридизации.621.3.1.3.
Биочипы «высокой плотности».Биочипы «высокой плотности» в настоящее время используются дляисследования экспрессии генов (1), для полногеномного анализа ассоциаций(GWAS) и сравнительной геномной гибридизации (CGH). Если приисследовании экспрессии генов наряду с ПЦР в реальном времени всебольше применяются технологии полногеномного секвенирования (см.п.1.3.2), то биочипы для GWAS анализа и метода CGH на сегодняшний деньостаются востребованными как отдельная технология.1.3.1.4.
Заключение.В настоящее время существует большое число методов молекулярныхисследований полиморфизма ДНК и тестирования известных мутаций. Этиметоды используют как в научных исследованиях, так и для молекулярнойдиагностики. В детекции нуклеотидных вариантов особое место занимаютразнообразные биочиповые методы. Благодаря компактности и низкойсебестоимости, данная технология даже в «эру NGS секвенирования»остается востребованной. Широкий спектр исследований на микрочипах всочетании с другими эффективными молекулярно-генетическими методами,такими как ПЦР в реальном времени, масспектрометрия и, конечно, ДНКсеквенирование открывает большие возможности для исследований вобласти персонализированной, предиктивной, превентивной медицины(медицины 3 П).1.3.2.
Технология полногеномного секвенирования.Наиболееперспективнымметодомопределенияпервичнойнуклеотидной последовательности является метод «глубокого» или NGSсеквенирования, с помощью которого можно получить полную информациюо типе и характере нуклеотидных изменений, а при анализе экспрессии генов- проводить её количественный анализ. Усовершенствованные технологиисеквенирования последних лет значительно облегчают не только «чтение»63амплифицированных фрагментов, но и позволяют проводить расшифровкупервичной нуклеотидной последовательности целых геномов.Насегодняшнийденьсуществуетмноговариантовгеномныхсеквенаторов, в основу которых положены разные технологии.1. Система «GS Junior» компании «Roche» использует технологиюпирофосфатного секвенирования, основанную на детекции активностиферментаДНК-полимеразыприеговзаимодействиисдругимхемилюминесцентным ферментом (см.
рис.8).Рисунок 8. Принцип метода пиросеквенирования (с сайта molbiol.ru).Длятехнологиипиросеквенированияхарактернавысокаячувствительность, достоверность, повторяемость результатов (точность выше99%) и специфичность секвенирования. Результат пиросеквенирования нетолько качественный, но и количественный, что имеет большое значение прианализе гетерозиготности, статуса метилирования или химеризма. Анализзанимает всего около 10 минут в отличие от стандартного секвенирования поСенгеру (24-55 часов). Несомненным достоинством этой технологии следуетсчитать также высокую степень автоматизации - процесс добавлениянуклеотидовианализрезультатовосуществляетсяспециальнымиустройствами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
