Диссертация (1144820), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Установлено, чтоассоциативные сети позволяют выявлять общие и специфичные факторы30риска сочетанных патологий. Впервые показано, что секвенированиеотдельных генов (на примере гена ACVR2A при гестозе) может бытьиспользовано для поиска аллелей риска мультифакторных заболеваний.Установлено, что значимыми молекулярными маркерами риска гестозаявляются аллели rs145399059С, rs17692648С, инсерция insAA в позиции148642724 гена ACVR2A. Протективным маркером гестоза является аллельrs17742573G гена ACVR2A. Впервые показано, что маркером гестоза на фонегипертонической болезни является изменение уровня следующих микроРНК:miR-135b-5p, miR-195-5p, let-7f-5p, miR-34c-5p, miR-1-3p, miR-98-5p, miR223-3p (снижение) и miR-515-3p, miR-31-5p, miR-210-3p, miR-518a-3p, miR524-3p, miR-518c-3p, miR-520a-3p, miR-515-5p, miR-516a-5p, miR-519e-5p,miR-193b-3p, miR-4532, miR-518f-3p, miR-518a-5p, miR-518e-3p (повышение).Теоретическая значимость работыТеоретическая значимость работы заключается в получение новыхзнаний в области патогенеза гестоза у женщин, артериальной гипертензии иметаболического синдрома с ожирением у детей.
В результате работыустановлены общие механизмы возникновения изученных заболеваний,основанные на присутствии в генотипе специфических вариантов геновренин-ангиотензиновой системы, обмена гомоцистеина и метаболизмалипидов.Разработанановаяметодологияисследованиярискамногофакторных заболеваний на основании комплексного подхода сприменениеммолекулярно-биологических,статистическихпоследовательностиметодов.Показанагенов-кандидатовибиоинформатическихзначимостьпроведенияиисследованияанализауровнямикроРНК для прогноза риска развития многофакторных заболеваний.31Практическая значимость работы:- разработана и внедрена в практику лечебно-профилактическихучрежденийбиочиповаятехнологиядиагностикинаследственнойпредрасположенности к мультифакторным заболеваниям;- разработаны оригинальные алгоритмы выделения с помощью генныхсетей общих и специфичных факторов риска мультифакторных заболеваний;- предложены и апробированы новые GLM и MDR модели дляобъективизациирезультатовкомплексныхгенетическихиклинико-лабораторных исследований с целью формирования групп повышенногориска мультифакторных заболеваний (гестоз, артериальная гипертензия,метаболический синдром и ожирение);- результаты работы могут служить основой для профилактики,диагностикииперсонализированойтерапиигестоза,артериальнойгипертензии, метаболического синдрома и ожирения у детей.Методология и методы исследованияВ работе использованы новые и стандартные методы молекулярнойгенетики человека, статистики и биоинформатики, а также разработаныновыеподходыдляскринингамутацийнаоснованиитехнологиибиологических микрочипов.
Проведена апробация биочиповой технологии.В работе использовали классические методы выделения ДНК и РНК(микроРНК) из разных биоматериалов, обработка ДНК бисульфитом натрия,обратная транскрипцию и получение кДНК (по Sambrook et al., 1989 и наосновании протоколов наборов реагентов, приведенных в п. 2.2-2.5).Концентрацию ДНК и РНК оценивали флуоресцентным методом с помощьюприбора «Qubit» (США). Количественную и качественную оценку ДНК,РНК,атакжеДНК-библиотекпроводилиметодоммикрочиповогоэлектрофоретического анализа распределения размеров фрагментов ДНК наприборах «2200 TapeStation Instrument» («Agilent technologies», США) и«MCE-202 MultiNA» («Shimadzu», Япония).32Праймеры подбирали с помощью стандартных программ («Oligo 6»,США).
Для получения ПЦР-продуктов использовали как «классическую»амплификацию, так и метод «удлиняющей» (long-range) ПЦР (Hernan et al.,2012).Для анализа однонуклеотидного полиморфизма были примененынесколько подходов. Стандартный ПЦР/ПДРФ анализ, новые методыдетекции однонуклеотидных замен посредством гибридизации на ДНКбиочипе, и массовое параллельное секвенирование ДНК на приборах «IonTorent» и «GS Junior».
Аннотирование и «фильтрацию» вариантов после NGSсеквенирования проб ДНК осуществляли с помощью известного ресурсаwANNOVAR (Wang et al., 2010; Chang et al., 2012) и нового интернет-ресурса«Gene-Talk» (http://www.gene-talk.de). Статистические расчеты проводили,используя PLINK (Purcell et al., 2007) и SnpSift (Cingolani et al., 2012).Функциональную значимость выявленных замен проводили с помощьюресурсов Polyphen2 (Kumar et al., 2009) и SIFT (Adzhubei et al., 2010).Для сравнительного анализа уровня транскрипции генов микроРНКтакже использовали метод массового параллельного секвенирования наприборе «Ion Torrent». Анализ профиля экспрессии генов микроРНКпроводили, используя новый алгоритм CAP-miRSeq (Sun et al., 2014).
Анализдифференциальной экспрессии генов (уровня микроРНК) проводили спомощью пакета edgeR» (Robinson et al., 2010).Для анализа метилирования остатков цитозина в ДНК использовалитри метода: метилчувствительную и метилспецифичную ПЦР, а такжекомбинированный бисульфитно-рестрикционный анализ.Для построения ассоциативных сетей использовали компьютернуюсистему «ANDSystem» (Demenkov et al, 2012) и «STRING» (Franceschini etal., 2013).Сравнение количественных показателей выборок на нормальностьпроводили с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборок поколичественным показателям осуществляли с помощью U-критерия Манна33Уитни, коэффициент корреляции вычисляли методом Спирмена, проверкусоответствия распределения комбинации аллелей ожидаемому рассчитывалиметодом 2, анализ межгенных взаимодействий проводили с помощьюпрограммы MDR (Ritchie et al., 2001), расчет показателя соотношенияшансов, построение логистических регрессионных моделей, «ROC-кривых»проводили с применением пакетов программ «GraphPad InStat» (США),«STATISTICA 12.0 (США) и в среде для статистических вычислений «R» cпомощью программы «R Cloud Workbench» (Goncalves et al., 2011).Основные положения, выносимые на защиту:•Разработанные биочипы обладают высокой чувствительностью испецифичностью для диагностики наследственной предрасположенности кмультифакторным заболеваниям.•Определенныеаллелигеновренин-ангиотензиновойсистемы,свертывания крови и метаболизма липидов являются факторами рискагестоза, артериальной гипертензии и метаболического синдрома с ожирениему детей.•Молекулярно-генетическимимаркерами,ассоциированнымисриском гестоза, являются аллели: rs11091046 гена AGTR2, rs1801133 генаMTHFR, rs1799768 гена SERPINE1, rs1799963 гена F2, rs7412 гена APOE, rsrs2368564 гена REN; артериальной гипертензии у девочек - rs7412 генаAPOE, rs1799983 гена NOS3, rs699 гена AGT, артериальной гипертензии умальчиков - rs11091046 гена AGTR2, rs5186 гена AGTR1, rs7412 гена APOE,rs1799983 гена NOS3, rs1801133 гена MTHFR, rs4340 гена ACE; ожирения иметаболического синдрома у девочек - rs11091046 гена AGTR2, rs328 генаLPL, rs7412 гена APOE и rs1799722 гена BR1 (BDKRB2), метаболическогосиндрома и ожирения у мальчиков - rs7412 гена APOE, rs699 гена AGT.•Приотсутствиипредпочтительноанамнестическихиспользоватьметодиклиническихмножественногоданныхсниженияразмерности (MDR), а при их наличии - более адекватно линейное34моделирование(GLM).Тестированиеопределенныхаллелейгенов-кандидатов, дополненное расчетами коэффициента соотношения шансов(OR), и оценкой риска на основании MDR и GLM моделей позволяетсформировать группу риска по мультифакторным заболеваниям.•Ассоциативные сети позволяют выявлять общие и специфическиефакторы риска сочетанных патологий.•Целевое NGS секвенирование позволяет идентифицировать новыемаркеры заболевания.
Значимыми молекулярными маркерами риска гестозаявляются аллели rs145399059С, rs17692648С, инсерция insAA в позиции148642724 гена ACVR2A. Протективным маркером гестоза является аллельrs17742573G гена ACVR2A.•Маркером гестоза на фоне гипертонической болезни являетсяизменение уровня микроРНК в плаценте: miR-135b-5p, miR-195-5p, let-7f-5p,miR-34c-5p, miR-1-3p, miR-98-5p, miR-223-3p (снижение) и miR-515-3p, miR31-5p, miR-210-3p, miR-518a-3p, miR-524-3p, miR-518c-3p, miR-520a-3p, miR515-5p, miR-516a-5p, miR-519e-5p, miR-193b-3p, miR-4532, miR-518f-3p, miR518a-5p, miR-518e-3p (повышение).Апробация работыОсновные теоретические и практические положения диссертации былипредставлены в виде устных докладов на следующих российских имеждународных конференциях и когрессах: «XI Конгресс педиатров России«Актуальные проблемы педиатрии», 2007, Москва; «Фундаментальная наукаи клиническая медицина», 2007, Санкт-Петербург; «1-ая Международнаянаучная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 2009,Пансионат «Заря”, Московская область, Ступинский район; «Российскийконгресс с международным участием «Молекулярные основы клиническоймедицины – возможное и реальное», 2010, 2015, Санкт-Петербург;«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клиническоймедицине»,2010,Москва;«IIвсероссийскаянаучно-практическая35конференция с международным участием «Медико-биологические аспектымультифакториальнойпатологии»,2011,Курск;«Всероссийскаяконференция с международным участием «Пренатальная диагностика игенетический паспорт – основа профилактической медицины в векнанотехнологий», 2012, Санкт-Петербург; «Workshop The 3rd OpenGENEYoung Investigator Workshop in The Baltic Region «Biobanking, NewTechnologies, Complex Genetic Traits and Personalized Medicine», 2012, Tartu,Estonia;«7-аяВсероссийскаянаучно-практическаяконференциясмеждународным участием «Здоровье – основа человеческого потенциала:проблемы и пути их решения», 2012, Санкт-Петербург; «XX РоссийскийнациональныйКонгресс«ЧеловекиЛекарство»,2013,Москва;«ДОНОЗОЛОГИЯ-2013», 2013, Санкт-Петербург; «VIII Всероссийскаянаучно-практическаяконференциясмеждународнымучастием«Молекулярная диагностика-2014», 2014, Москва; «VI съезд Вавиловскогообщества генетиков и селекционеров», 2014, Ростов-на-Дону; «X научнаяконференция «Генетика человека и патология: проблемы эволюционноймедицины», 2014, Томск; «VII съезд Российского общества медицинскихгенетиков»,2015,«ДискуссионныеСанкт-Петербург;вопросы«IIIсовременногоНациональныйакушерства»,2015,конгрессСанкт-Петербург; «Международная научная конференция Научного Парка СПбГУ«Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарныхисследований в аспекте внедрения в практическую медицину», 2015, СанктПетербург; и на научных семинарах лаборатории пренатальной диагностикиФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О.Отта» и кафедры генетики и биотехнологииСПбГУ.Кроме того, результаты работы были представлены в виде постерныхдокладов на Европейских конгрессах по генетике человека (EuropeanCongress of Human Genetics Conference (ESHG), 2006, Amsterdam, TheNetherlands; 2007, Nice, France; 2008, Barcelona, Spain; 2010, Gothenburg,Sweden; 2011, Amsterdam, Netherland; 2013, Paris, France; 2015, Glasgow,36Scotland,UnitedKingdom);наконференциипоперспективнымисследованиям в биологии (Biologie Prospective - Santorini Conference), 2008,Santorini Island, Greece; V съезде ВОГиС, 2009, Москва; международнойконференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Институтаобщей генетики им.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
