Диссертация (1144820), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Вклад полногеномного секвенирования гена для оценки рискагестоза.Как показывает пример АГ и многих других МФЗ, полногеномныйскрининг ассоциаций (GWAS) не является достаточным для выявления всехпричинных факторов и всех кандидатных генов, вовлеченных в заболевание(Zuk et al., 2012).Более полная информация о молекулярных механизмах патогенезаМФЗ может быть получена только с использованием методов и подходовсистемной генетики (Баранов, 2013). Для этого необходимо не толькоисследованиединамическогогенома(эпигенома,экспрессиигенов,межгенных взаимодействий и др.), но и тотальный скрининг всего геномаили первичной нуклеотидной последовательности гена-кандидата и соседнихс ним последовательностей ДНК (Zuk et al., 2012).Еслиподходыкисследованиюдинамическогогеноматолькоразрабатываются, то высокоточный метод тотального скрининга уже широко335336используется.
Таковым является технология секвенирования следующегопоколения с использованием различных платформ (Скрябин и др., 2009).Применениетехнологийполногеномногосеквенированиявисследовании молекулярно-генетических причин риска развития моногенныхи мультифакторных заболеваний на сегодняшний день становится рутинным.Однако в своем большинстве такие работы подразумевают скрининг не всегогенома из-за высокой стоимости этого исследования, а анализ экзомов,кодирующих участков таргетных генов, либо секвенирование отдельныхгенов.Намииспользованметодполногеномногосеквенированиядляизучения особенностей нуклеотидных замен в одном из важных генов рискаразвития гестоза - гена ACVR2A.
Продукт этого гена регулирует инвазиютрофобласта, и его уровень существенно повышен у женщин с гестозом(Dijk, Oudejans, 2013). Однако, структурно-функциональная организация генаACVR2A неизвестна. Неясно и то, как изменения первичной нуклеотиднойпоследовательности этого гена влияют на его функции.
Известно, чтопоследовательность гена ACVR2A составляет около 90 тыс.п.н., в которойуже выявлено более 8000 различных вариаций (http://www.ensembl.org),большинство из которых находиться в интронах и только 9 – в экзонах (Dijk,Oudejans, 2013).В настоящей работе NGS секвенирование проведено с помощью двухальтернативных технологий. В обоих случаях выборочный анализ новыхвариантов первичной нуклеотидной последовательности гена «ручномрежиме» - с помощью программы «UGENE» (Okonechnikov et al., 2012),показал, что значительная часть из них (делеции одного нуклеотида) сбольшой долей вероятности, являются ошибками.
Этот факт подчеркиваетважную особенность NGS секвенирования – его гиперчувствительность(наличие ложноположительных результатов). Традиционными методами иресурсами биоинформатики (Wang et al., 2010; Chang et al., 2012) эту задачуна сегодняшний день пока решить нельзя.336337Поэтому для поиска «ключевых» нуклеотидных вариантов гестозабыли применены различные подходы. С одной стороны, был использован«чисто» биоинформатический подход на основе алгоритмов PolyPhen и SIFT,нацеленный на поиск нуклеотидных вариантов, значимо меняющих функциюфермента ACVR2A. Данный подход не «увенчался» успехом (см.
п.3.2.1.2.2.1), так как ни одного существенно значимого варианта обнаруженоне было.С другой стороны, используя ресурс «Gene-Talk», в группе больныхгестозом были отобраны несколько десятков «клинически значимых»вариантов гена ACVR2A. Часть выявленных вариантов соответствовала ранееизвестным маркерам гестоза.
В частности, в работе Фицпатрик с коллегамибыла показана ассоциация с гестозом вариантов rs10497025 и rs13430086(Fitzpatrick et al., 2009). Другие пять выявленных нами вариантов: rs1014064,rs17742134, rs2161983, rs3768687, rs3764955, ранее были описаны какмаркеры гестоза норвежскими авторами (Roten et al., 2009).
В работахотечественных авторов была установлена ассоциация между вариантомrs17742134 и тяжестью течения гестоза (Ворожищева и др., 2013). Однакопри дальнейшем анализе данные варианты (за исключением rs3768687,rs3764955) были обнаружены и в контрольной группе, что ставит подсомнение их ассоциацию с гестозом в нашей выборке.«Медицинскизначимые» варианты были использованы идляисследования корреляций между показателями САД, ДАД, концентрациейбелка в моче, наличием отеков у беременных женщин с гестозом и степеньютяжести болезни.
Статистически значимая корреляция была показана толькомежду rs1364657, rs7601098, rs3820716 гена ACVR2A и белком в моче, междуrs7601098 – и диастолическим артериальным давлением (p<0,03) и междувариантом rs3764955 и тяжестью гестоза и появлением отеков (Глотов и др.,2014).Помимо упомянутых выше подходов нами было проведено сравнениерезультатов секвенирования гена ACVR2A у женщин с гестозом с таковыми в337338контрольной группе. Используя разработанный «score» подход (Glotov et al.,2015б), были получены принципиально новые результаты.
Так, былообнаружено более 20-ти нуклеотидных замен, ассоциированных с гестозом,одна из которых (rs17692648) соответствовала «медицински значимому»«Gene-Talk»-варианту. Наиболее интересными заменами, согласно SNPSIFTтесту, оказались инсерция insAA в позиции 148642724, связанная с рискомболезни, и протективная замена A на G в позиции 148643956 (rs17742573).Таким образом, с помощью NGS впервые были выявлены не толькопотенциально новые маркеры гестоза, но такие нуклеотидные замены в этомгене, которые имеют протективное действие.Биоинформатический«фильтеринг»сиспользованиемресурсаwANNOVAR, позволил выявить четыре интронные замены (rs147685348,rs76633300, rs3754541, rs2288190), локализованные в сайтах связываниянекодирующих РНК.
Возможно, эти замены вовлечены в регуляциюэкспрессии данного гена, посредством модификации сайта связыванияспецифической микроРНК. Для гена ACVR2A известно более двадцатимикроРНК, при чем, для некоторых из них (microRNA-181a) на модельномобъекте (мышь) показана значимая обратная корреляция между уровнемэкспрессии данной микроРНК и ортологичным гену человека геном - acvr2a(Zhang et al., 2013).Таким образом, полученные результаты подтверждают участиепродукта гена ACVR2A в развитии гестоза.
Выявленные маркеры рискасвидетельствуютвпользуэтогопредположения,однакотребуютдальнейшего и более углубленного изучения.4.2.2.3. Оценка уровня микроРНК для предсказания риска развития гестоза.Считается, что гестоз не самостоятельное отдельное заболевание, аскорее, синдромокомплекс, причиной которого могут быть разные факторы,а следствием, один и тот же патофенотип (Айламазян, Мозговая, 2008).Согласно такой точке зрения, причиной разных форм одной и той же338339патологии может быть определенный метаболический триггер. Такимтриггером в частности, могут быть регуляторные микроРНК (Zhao et al.,2013; Fu et al., 2013).Известно, что каждая микроРНК, контролирует экспрессию многихгенов (в среднем около 20) и, соответственно, нарушение её синтеза можетбыть причиной разных заболеваний, как синтропных, то есть имеющихобщую молекулярно-генетическую основу, так и достаточно отдаленных посвоимпатоморфологическимиклиническимпроявлениям(Кучер,Бабушкина, 2012).Исследованиями in vitro показано, что микроРНК необходимы длянормального развития беременности и могут регулировать такие процессы,как ангиогенез, апоптоз, инвазию, пролиферацию и миграцию клетоктрофобласта (Fu et al., 2013).
Существуют даже определенные микроРНК,которые детектируют только во время беременности (как нормальной, так ипатологической). Таких микроРНК уже выявлено более 100 (Miura et al.,2010; Zhao et al., 2013).Нами показано, что miR-23a-3p, miR-517a(b)-3p и miR-518e-3pпреобладают в пуле микроРНК, обнаруженных в образцах плацент (см. табл.36). Преобладание miR-517a(b)-3p и miR-518e-3p в клетках трофобластавполне согласуется с уже известными данными (Miura et al., 2010; Yang et al.,2011; Zhao et al., 2013). Вместе с тем, микроРНК miR-23a-3p ранее не былаидентифирована среди доминирующих (Hu et al., 2009), хотя и былаобнаружена в плаценте здоровых и больных женщин (Ishibashi et al., 2012).Исследования роли микроРНК непосредственно в патогенезе гестозаначаты сравнительно недавно.
Первые публикации датированы 2007 годом(Pineles et al., 2007). При изучении 157-ми микроРНК из образцов плацентыпосле гестоза выявлена гиперэкспрессия miR-182 и miR-210.Особое внимание на сегодняшний день в связи с патогенезом гестозауделяют микроРНК, кодируемые так называемым C19MC кластером,расположенным на хромосоме 19. Этот кластер специфичен для приматов и339340его экспрессия ограничена преимущественно плацентой (Chen et al., 2013).Кластер имеет протяженность 100 т.п.о. (19q13.41) и содержит 54 микроРНК,43 из которых клонированы и секвенированы (Chen et al., 2013).
ЭтимикроРНК кодируются и процессируются из интронов транскрипта белокнекодирующей полимеразы II и вовлечены в регуляцию геномногоимпритинга. Таким образом, абберантная экспрессия данного кластера можетсерьезно влиять на функцию плаценты (Chen et al., 2013).В нашем исследовании не было обнаружено специфических маркеровгестоза в целом (см. п. 3.2.1.2.4), но были обнаружены маркеры гестоза нафоне сочетанного заболевания – гипертонии, что говорит еще раз в пользупредположения о том, что данная патология представляет собой сложныйсиндромокомплекс, молекулярно-генетические механизмы которого следуетрассматривать только с учетом клинических данных.Необходимо отметить, что некоторые из микроРНК, выявленные намипри гестозе на фоне гипертонии, соответствуют ранее установленныммаркерам данного заболевания другими авторами (Zhu et al., 2009; Ishibashi etal., 2012; Chen et al., 2013).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
