Диссертация (1144791), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Дляморфометрического анализа на нескольких срезах при увеличении ×400подсчитывали количество морфологически неизмененных пирамидных нейроновдля различных полей гиппокампа и затылочной области (occipital cortex) корыголовного мозга, в ее отдельных слоях, а именно, в слое II - наружном зернистом;в слое III – наружных пирамидных нейронов; в слое V – внутреннем пирамидном.Полученные количественные показатели пересчитывали на 1 мм протяженностипирамидного слоя для полей гиппокампа и на 1 мм2 для послойного анализа корыголовногомозга.Морфологическинеизмененныенейроныоцениваливсоответствии с существующими критериями оценки: четко очерченное ядро96эллипсоиднойилиокруглойформы;хорошоразличимыеядрышки,расположенные в центре ядра; ядро немного темнее, чем окружающийнейропиль; цитоплазма нейронов четко отграничена от окружающего нейропиля(Stummer W.
et al., 1994). Учитывались нейроны, сохранившие жизнеспособность(т.е. морфологически неизмененные нейроны) и содержащие в площади срезаядрышко (Kirino T., 1982).2.8 Методика иммуногистохимической детекции белка Bcl-2В нейронах коры головного мозга и пирамидного слоя полей гиппокампаиммуногистохимическим методом выявляли уровень экспрессии белка Bcl-2.Суть иммуногистохимического метода заключается в следующем: экспрессиябелка выявляется иммуногистохимическим двушаговым непрямым методомсвязывания полимерной цепи с первичными неконьюгированными антителами.Это связывание происходит за счет взаимодействия первичных моноклональных(мышиных или кроличьих) или поликлональных (кроличьих) антител с антимышиными и анти-кроличьими козьими иммуноглобулинами.
На полимернойцепи также находится энзим (пероксидаза хрена), активация которого позволяетвизуализировать метку. Вызываемое ферментом химическое преобразованиехромогена на конечном этапе иммуногистохимического анализа приводит котложению в местах образования иммунного комплекса окрашенного продукта.Наиболее распространенной меткой является пероксидаза хрена, а в качествесубстрата хромогена используется 3,3'-диаминобензидинатетрахлорид (ДАБ).Продукт полимерной природы коричневого цвета, образующийся в ходе реакции,нерастворимворганическихрастворителях,чтопозволяетзаключатьокрашенные срезы в оптически прозрачные среды (канадский бальзам,синтетические полимеры) и получать постоянные препараты, пригодные длядлительного хранения (Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е., 2006).Фронтальные парафиновые гистологические срезы мозга толщиной 5 мкмна предметныхстеклахсоспециальным адгезивным поли-L-лизиновым97покрытием(Menzel,депарафинированияГермания)иподвергалирегидратации.Далеестандартнойосуществлялипроцедуретепловоедемаскирование антигена в цитратном буфере pH 6,0 (DiagnosticBioSystems,США) в течение 60 мин.
и инкубацию в течение 30 мин. при комнатнойтемпературе. На первом этапе инкубацию срезов проводили с поликлональнымикроличьими антителами к Bcl-2 (Abcam Ltd, Великобритания). Антителаразводили 1:100 на блокирующем растворе (Diagnostic BioSystems, США). Длявыявления комплекса антиген-антитело применяли набор реагентов NovocastraPeroxidaseDetectionSystem(Novocastra,Великобритания).Продуктиммуноцитохимической реакции выявляли при помощи хромогена DAB+(Novocastra, Великобритания).
Препараты докрашивали гематоксилином Джилла(Bio-Optica, Италия). Экспрессию белка Bcl-2 в нейронах анализировали наосновании результатов измерения оптической плотности продукта реакции,которую осуществляли с помощью морфометрической установки, состоящей изсветового микроскопа Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Германия), цифровой камерыBaumer CX05e (Baumer, Германия), компьютера с программным обеспечением«Видео-ТесТ-Морфология» (ООО «ВидеоТесТ», Россия).
Результаты анализавыражали в относительных единицах (отн. ед.) оптической плотности. В каждойанализируемой области головного мозга проводили измерение оптическойплотности в цитоплазме 50 морфологически неизмененных нейронов, тех, гдесрез прошел через ядрышко. При каждом измерении вычитали оптическуюплотность фона.2.9 Методика гистохимического исследования внутриклеточной активностисукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназыМетоды гистохимического анализа основаны на том, что клеточныеферментыявляютсянепосредственнонаправлениеивмаркерамиобменныхклетке.Изменениединамикасдвигапроцессов,активностипроисходящихферментов,свидетельствуютобатакжеизменении98морфофункционального состояния исследуемой биоструктуры.
Гистохимическоеисследование проведено в лаборатории патоморфологии (зав. - к.б.н., доцентГ.Ю. Юкина) Научно-исследовательского центра (директор – д.м.н., профессорВ.В. Томсон) ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России.Для гистохимического исследования мозг извлекали из полости черепа,нарезали на сегменты, используя фронтальную матрицу для головного мозгамелких грызунов (WPI, США), затем ступенчато замораживали, проводя черезохлажденный изооктан в жидком азоте. Заготовленные образцы мозга хранили вжидком азоте при температуре -179ºС.
С помощью криостата (при -20ºC)готовилисрезымозгавофронтальнойплоскоститолщиной10мкм,соответствующих стереотаксическим атласам для песчанок брегма -1,7±0,2 мм(Loskota W.J., 1974) и для крыс брегма -3,6±0,2 мм (Paxinos G., Watson Ch., 1998).На криостатных срезах гистоэнзимологическими методами выявлялиактивность окислительно-восстановительных ферментов – лактатдегидрогеназы(ЛДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в нейронах слоев II, III и V коры и полейСА1, СА2, СА3 и СА4 гиппокампа. ЛДГ - фермент завершающего этапагликолиза, один из регуляторов пируватдегидрогеназного комплекса.
СДГ - этофермент, локализованный на внутренней мембране митохондрий и являющийсякомпонентом электрон-транспортной цепи. В цикле трикарбоновых кислот СДГкатализирует обратимое окисление янтарной кислоты (сукцината) до фумаровойкислоты.Активность СДГ и ЛДГ выявляли стандартными гистоэнзимологическимиметодами с применением солей тетразолия по З.
Лойда (Лойда З. с соавт, 1982).Для выявления продуктов реакции использовали растворы субстратов к ЛДГ –лактат Na (Fluca, Германия), к СДГ - сукцинат Na (Fluca, Германия). Далее наспектроцитофотометре (ОАО «ЛОМО», Россия) плаг-методом при увеличении×280 (площадь зонда составляла 0,785 мкм2, длина волны - 545 нм) определялиоптическую плотность продукта реакции (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977;Прочуханов Р.А. с соавт., 1978).
Результаты цитофотометрического анализавыражали в относительных единицах (отн. ед.) оптической плотности (D). На99препарате у каждого животного проводили по 50 измерений D в цитоплазмеморфологически неизмененных нейронов пирамидного слоя полей СА1, СА2,СА3, СА4 гиппокампа, а также в цитоплазме нейронов слоев II, III и V корымозга.2.10 Оценка функциональной активности компонента С3 системыкомплемента в сыворотке крови крысДляизученияактивациикомпонентовсистемыкомплементаприишемическом и реперфузионном повреждении тканей головного мозга, а такжепри применении ИПостК, проводили анализ функциональной активностикомпонента С3 системы комплемента (КС3СК) в сыворотке крови крыс.Кровь для получения сыворотки отбирали после декапитации крыс всоответствии с протоколом эксперимента, после чего выдерживали прикомнатной температуре в течение 15 минут и центрифугировали при 1500об./мин.
в течение 15 минут. Затем собирали сыворотку в пробирку Эппендорфа,замораживали и хранили при температуре -30°С, не допуская размораживания допроведения анализа, не более месяца. Функциональную активность С3 всыворотке крови крыс определяли с использованием реагента RC3.
Реагент RC3представляет собой смесь донорских сывороток крови человека, в которой белокС3 был предварительно инактивирован (Козлов Л.В. с соавт., 1987) смодификациями (Бельтюков П.П. с соавт., 2003). В ходе анализа к реагенту RC3(0,2 мл) добавляли 0,2 мл мединалового буфера, содержащего 17 мМ Mg2+ и 5,1мМ Ca2+, 0,3 мл 0,9% раствора NaCl и 0,02 мл исследуемой сыворотки кровикрыс, предварительно разведенной в 6 раз 0,9% раствором NaCl. Послепрогревания смеси (3 мин., 37оС) в неё вносили 0,1 мл стандартной суспензииэритроцитов кролика (около 1,2×106 эритроцитов/мл). В такой смеси благодаряприсутствию как ионов магния, так и ионов кальция активация комплементавозможна по любому из существующих механизмов.
Кинетику комплемент опосредованного гемолиза регистрировали фотометрически в термостатируемой100при 37ºС кювете (l=5 мм) на спектрофотометре СФ-46 (ОАО «ЛОМО», Россия) срегистрацией оптической плотности при 800 нм каждые 5 секунд. Былиопределены: лаг-период (Tlag) - время инкубации смеси от момента добавленияэритроцитов до начала эффективного гемолиза, скорость лизиса (Vlys) –максимальная скорость гемолиза, которая определяется как снижение оптическойплотности инкубационной смеси в единицу времени (dE800/5″) и Tmax – времядостижения Vlys.2.11 Методы статистического анализаСтатистическую обработку результатов проводили в соответствии срекомендациями по обработке данных медико-биологических исследований(Гланц С., 1999), с использованием программ "STATISTICA 6.0" (Stat Soft Inc.,США) и Мicrosoft Excel 2003. Данные приводятся как средние арифметическиезначения с его стандартными ошибками или как среднее с его стандартнымотклонением, также вычисляли медиану (Ме) и приводили размах междуминимумом и максимумом (min-max).
После проверки распределения нанормальность значимость различий между группами оценивали с помощью tкритерия Стьюдента, если распределение отличалось от нормального, тоиспользовали U-критерий Манна-Уитни. Также для анализа результатовприменяли точный критерий Фишера. Различия считали значимыми при Р<0,05.101ГЛАВА 3.РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ПОЛНОЙ ГЛОБАЛЬНОЙИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС3.1 Моделирование полной глобальной ишемии-реперфузии головного мозгау крысЗадачей данной разработки являлось создание модели полной глобальнойишемии головного мозга, проводимой в один этап и позволяющей моделироватьишемическое и реперфузионное повреждение всего головного мозга заданнойпродолжительности с наименьшими травматическими последствиями и высокимпроцентом достижения состояния глобальной ишемии.Проведение экспериментального исследования проходило в условиях общейанестезииипневмоторакса,поэтомубылонеобходимовыполнениеискусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) с помощью аппарата SAR830 (CWE Inc.,США), в режиме постоянного дыхательного объёма.
Воздух, нагнетаемыйаппаратом ИВЛ, поступал в легкие животного через интубационную трубку.После наркотизации крыс интубировали при помощи, специально разработаннойи запатентованной интубационной трубки (патент на полезную модель RUS121389 27.04.2012) (рис. 3.1). Интубационная трубка была выполнена в видецилиндра, проксимальный конец которой соединен с выходным шлангомаппарата для ИВЛ, а дистальный конец выполнен в виде эндотрахеальной трубки,вводимойвтрахеюживотногочерезголосовующель.Такжетрубкадополнительно снабжена отводом для аспирации слизи и переходником,предназначенным для соединения интубационной и эндотрахеальной трубок.Эндотрахеальная трубка выполнена съёмной, а отвод для аспирации слизи былзакреплен на интубационной трубке под углом и имел заглушку.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
