Диссертация (1144791), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Сосуды мозга с вентральной стороны. 1 – ветвь a. cerebri rostralis, 2 – v. cerebri dors., 3 – tr.olfactorius, 4 - a. cerebri rostralis, 5 - a. cerebri media, 6 – a. choroidea, 7 – v. basalis, 8 – a. communicans caud., 9 - a.cerebri caud., 10 – v. cerebri ventr (через sinus petrosus dors. к sinus transverses), 11 - a. cerebelli rostralis, 12 –paraflocculus, 13 – a.
basilaris, 14 – n. trigeminus, 15 – n. trochlearis, 16 – a. carotis int., 17 – infundibulum (перерезана),18 – n. opticus (Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л., 2001)Для обеспечения доступа к ЛОСА в нижней трети шеи проводили кожный разрезпо средней линии. После разведения в стороны кожи и глубоких мышц шеивыделяли сосудисто-нервный пучок и из его состава препарировали ЛОСА, накоторую накладывали микрохирургическую клипсу. По прошествии 30 минутоперационные раны послойно ушивали.Рис. 2.2. Вид операционного доступа к средней мозговой артерии (a. cerebri media) крысы.90В послеоперационном периоде осуществляли непрерывное наблюдение засостоянием животного до момента выхода из наркоза.
На рисунке 2.3представлено схематическое изображение анатомических вариантов строениякорковой ветви СМА относительно трепанационного окна и точки коагуляции.Припроведенииманипуляции,ложнойкромеоперацииперманентнойпроводилиокклюзиивсеСМАхирургическиеиналожениямикрохирургических зажимов на ЛОСА.АБВРис. 2.3. Схема анатомических вариантов строения корковой ветви средней мозговой артерииотносительно трепанационного окна и точек коагуляции: А – магистральный тип, Б –рассыпной тип, В – смешанный тип; 1 – средняя мозговая артерия, 2 – точки коагуляции, 3 –границы трепанационного окна.2.2.3 Моделирование хронической церебральной гипоперфузии у крысХроническую церебральную гипоперфузию головного мозга у крысмоделировали постоянной двусторонней окклюзией ОСА, не затрагиваяприлежащих нервных стволов и сплетений с последующим ушиваниемоперационной раны.
Следует отметить, что билатеральная перманентнаяокклюзия ОСА также может использоваться и для моделирования остройнеполнойишемииПоследовательностьпереднегофазмозга у крысишемического(FarkasповрежденияE.etal.,головного2007).мозга,индуцированного постоянной окклюзией ОСА, представлена на рисунке 1.5.912.3 Методика воспроизведения ишемического прекондиционирования ипосткондиционирования головного мозгаИПреК и ИПостК – это эндогенные механизмы нейропротекции,представляющие собой процесс, при котором серия коротких ишемическихстимулирующих воздействий, выполненных накануне или после повреждающей(тестовой) ишемии приводит к формированию толерантности головного мозга кишемическому и реперфузионному повреждению.Продолжительность окклюзии, количество ишемических стимулов иинтервалов между ними соответствовали разработанному протоколу для каждогоэксперимента.
При однократном 5-минутном ишемическом стимулирующемвоздействии накладывали микрохирургические зажимы, при выполнении двух иболее стимулов меньшей продолжительности для минимальной травматизациисосуда ишемические стимулы выполняли путем поднятия артерий на лигатурах.2.4 Методика определения размера экспериментального инфарктаголовного мозгаДля определения размера инфаркта в экспериментах с фокальной ишемиейголовного мозга использовали общепринятый дифференциальный индикаторныйметод, позволяющий на макроскопическом уровне отграничить необратимоповрежденную (некротизированную) ткань мозга от ткани, сохранившейжизнеспособность, в пределах области головного мозга, подвергшейся ишемии(Chen S.T.
et al., 1986).После декапитации мозг быстро извлекали из полости черепа и аккуратнонарезали на 5 сегментов толщиной 3 мм, используя фронтальную матрицу дляголовного мозга мелких грызунов (WPI, США). Далее срезы инкубировали притемпературе 37°С (pH 7,4) в течение 15 минут в 2% растворе 2,3,5 трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) (Sigma, США) с последующей фиксацией в10% забуференном формалине (Chen S.T. et al., 1986). ТТХ окрашивает92жизнеспособную ткань с сохраненной активностью НАД–зависимых ферментов вярко–красный (кирпичный) цвет за счет образования микрогранул формазана,тогда как зона некроза сохраняет нативный бледно-розовый цвет.
Каудальныеповерхности срезов мозга фотографировали цифровой камерой Olimpus CamediaС-2020 (Olimpus, Япония), совмещенной со стереомикроскопом МБС–10 (ОАО«ЛОМО»,Россия)посредствоммикрофотографическогоустройства.Дляпредотвращения образования световых бликов, срезы для фотографированияпомещали в низкий бюкс, заполненный физиологическим раствором так, чтобыжидкость покрывала поверхность среза. Затем получали цифровые фотографииповерхности срезов. Размер инфаркта рассчитывали планиметрически поплощади ТТХ-негативных зон при помощи программы ImageJ (ImageJ, NIH,США). Оценивали процентное отношение суммы площадей ТТХ-негативных зонк сумме общей площади коры левого полушария мозга (Самойленкова Н.С. ссоавт., 2008; Chen S.T. et al., 1986).
Размер повреждения вычисляли послепроведения коррекции значения с учетом отека по формуле, предложенной R.A.Swanson с соавторами (Swanson R.A. et al., 1990):%VI = 100 × (VC – VN)/VC.(1)где VN – размер ипсилатеральной коры левого полушария, сохранившейжизнеспособность; VC – общий размер ипсилатеральной коры правогополушария.Размер инфаркта головного мозга для каждого животного вычисляли каксреднее арифметическое значений, полученных для 5 срезов (Chen S.T. et al.,1986).2.5 Оценка неврологического дефицитаДля анализа неврологических нарушений, вызванных экспериментальнойишемией головного мозга, применяли метод оценки индекса неврологическогодефицита по шкале оценки инсульта (stroke-index), разработанной С.Р.
McGraw(1977) с модификациями, предложенными K. Ohno с соавт. (1984). Тяжести93состояния соответствовал определенный балл (табл. 2.1). Итоговый балл (индекс)высчитывали как сумму баллов, оценивающих отдельные неврологическиесимптомы. При этом значение итогового балла 23 свидетельствовало омаксимальной выраженности неврологических нарушений, а 0 баллов – об ихотсутствии.Таблица 2.1Шкала оценки неврологических нарушений (McGraw C.P., 1977)с модификациями (Ohno K.
et al., 1984)№123456789Неврологический симптомИндекс повреждения,баллыВзъерошенность волосяного покрова илитреморПритупление чувствительности, вялость,замедленность движенийИзменения слуха (прижатие ушей)Запрокидывание головыПтозПарез конечностейМанежные движенияСудороги или двигательнаягиперактивностьКоматозное состояние111323336Животные всех экспериментальных групп перед началом экспериментовбыли протестированы для оценки неврологического дефицита. При этом во всехгруппах животные исходно не имели неврологических нарушений.2.6 Учет летальности животныхОбщую летальность вычисляли как отношение количества невыжившихживотных к концу эксперимента (или к анализируемой точке эксперимента) кобщему числу животных в каждой группе.942.7 Методика морфологического и морфометрического анализаЖивотных наркотизировали, извлекали мозг из полости черепа и нарезалина сегменты, используя фронтальную матрицу для головного мозга мелкихгрызунов (WPI, США).
Сегмент, содержащий зону гиппокампа, фиксировали 10%нейтральным формалином и заливали в парафин по общепринятой методике (рис.2.4) (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Коржевский Д.Э.,Гиляров А.В., 2010; O’Neill M.J., Clemens J.A., 2001).Рис. 2.4. Этапы подготовки головного мозга для проведения морфометрического анализа(O’Neill M.J., Clemens J.A., 2001).Далее из парафиновых блоков при помощи санного микротома Microm HM430 (Carl Zeiss, Thermo Scientific, Германия) готовили фронтальные срезытолщиной 5 мкм.
Для обзорной общегистологической оценки фронтальные срезы,95соответствующие стереотаксическому атласу головного мозга монгольскойпесчанки брегма -1,7±0,2 мм (Loskota W.J., 1974) и головного мозга крыс брегма 3,6±0,2 мм (Paxinos G., Watson Ch., 1998), окрашивали гематоксилином и эозином(рис. 2.5).Рис. 2.5. Схематичное изображение фронтального среза головного мозга крысы,соответствующее брегма -3,6±0,2 мм; 1 – неокортекс; 2 – анализируемая область неокортекса: retrosplenialgranular cortex (RSG) retrosplenial agranular cortex (RSA), occipital cortex, area 2, lateral (Oc2L), occipital cortex, area2, mediolateral (Oc2ML), occipital cortex, area 2, mediomed (Oc2MM) (по G.
Paxinos, Ch.Watson, 1998).Для морфометрического анализа морфологически неизмененных нейроновпрепараты окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля (Саркисов Д.С.,Перов Ю.Л., 1996). На окрашенных препаратах, под световым микроскопом ДМ750 (Leica, Германия) при увеличении ×400 (об. 40, ок. 10) проводиликачественный и количественный морфологический анализ полей СА1, СА2, СА3и СА4 гиппокампа и слоев II, III и V коры головного мозга.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
