Диссертация (1144791), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В то же время,большой теоретический и практический интерес связан с длительностьюиндукции нейропротективного фенотипа. Для проведения исследования поизучению длительности протективного эффекта на структуры головного мозгаможетпотребоватьсяиспользованиеопределенногорежимаповторныхишемических стимулирующих воздействий и различных сроков реперфузионногопериода после повреждающей (тестовой) ишемии. Очевидно, что реализация этойзадачи позволит расшифровать фундаментальные механизмы адаптивныхреакций и сыграет важную роль в профилактике ишемического повреждениянервной ткани у пациентов с повышенным риском наступления ишемическогоинсультаипритренировкеэкстремальными ситуациями.организмачеловекапередвозможными83Таким образом, изучение как общих основ формирования ишемическойтолерантности головного мозга, так и тонких молекулярных механизмов данныхфеноменов позволит приблизиться к пониманию фундаментальных эволюционнозакрепленных принципов формирования физиологической адаптации мозга.Для проведения последующих экспериментальных работ и составленияточных рекомендаций по проведению доклинических исследований ИПреК иИПостК необходимо иметь однозначные ответы на следующие вопросы:1.Какова максимальная продолжительность тестовой ишемии головногомозга, при которой еще сохраняется значимый нейропротективный эффект отпримененияпрекондиционирующихилипосткондиционирующихстимулирующих воздействий?2.Каким должен быть протокол ИПреК и ИПостК для обеспечениямаксимально выраженного эффекта нейропротекции? При разработке протоколаследует учитывать такие переменные, как число применяемых ишемическихстимулирующих воздействий, их длительность, интервал между нанесениемстимулов и началом тестовой ишемии, вид стимулов.3.Также необходимо учесть эффективность действия в сочетании свозрастом,полом,повреждения,сопутствующейсовместнымпатологией,применениемсвидомнейропротекторов,ишемическогоприкоторыхцелесообразно использовать данный вид нейропротекции.К сожалению, многие из перечисленных вопросов до сих пор остаютсяоткрытыми даже при анализе многочисленных экспериментальных исследований.Постижение основных молекулярных механизмов формирования адаптацииголовного мозга сдерживается отсутствием сведений об изменении активностиферментовокислительно-восстановительныхреакций,протекающихнепосредственно в нейронах различных структур мозга, обладающих различнойчувствительностью к ишемическому повреждению, а также при примененииэндогеннойнейропротекции.Пониманиеадаптивнойперестройкиэнергетического метаболизма нейронов в ответ на неблагоприятные факторывнешней и внутренней среды организма, во многом позволит расширить84представление о наборе физиологических реакций и механизмах формированиятолерантностикишемическомуиреперфузионномуповреждениюприприменении сублетальных ишемических стимулирующих воздействий.
Насегодняшний день противоречивы и немногочисленны сведения об измененииуровняэкспрессиибелкаBcl-2внейронах,обладающихразличнойчувствительностью к повреждающему действию ишемии-реперфузии, а такжепри применении ишемических стимулирующих воздействиях. По-прежнему нетсведений об изменении иммунного ответа при применении ишемическихпосткондиционирующих стимулов. Малочисленны и неоднозначны результатыработ, посвященных изучению влияния ИПостК и ИПреК на процессэксайтотоксичности при ишемии-реперфузии головного мозга.Учитывая вышеизложенные противоречивые результаты исследованийэффектов и механизмов ИПостК и ИПреК, в настоящем исследовании, преждевсего, необходимо разработать экспериментальную модель полной глобальнойишемии-реперфузии головного мозга, позволяющую изучать возможностиэндогенной нейропротекции. Важно определить влияние ИПостК и ИПреК нафизиологические,функциональные,морфологические,метаболическиеибиохимические параметры при моделировании полной глобальной ишемииреперфузии головного мозга на различных экспериментальных моделях.Предстоит оценить эффективность применения ИПостК в зависимости отанатомического варианта строения корковой ветви СМА у крыс Wistar прифокальной ишемии головного мозга.
Кроме того, в задачи исследования входитопределениеролирецепторныхсистем,участвующихвреализацииэксайтотоксичности, в обеспечении нейропротективного эффекта ИПостКголовного мозга. Также важно проанализировать эффективность совместногоприменения ИПреК и ИПостК и нейропротектора цитиколина при глобальнойишемии-реперфузииголовногомозга.Определениезащитныхэффектовишемического пре - и посткондиционирования головного мозга на различныхэкспериментальных моделях ишемии-реперфузии позволит выявить механизмыфизиологической адаптации головного мозга к неблагоприятным факторам85внешней и внутренней среды организма, а также будет способствоватьоптимизации способов нейропротекции в клинической практике в рамкахреализации концепции трансляционной медицины.86ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты экспериментального исследования (лабораторные животные)Все эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациямиэтического комитета ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинскийисследовательский центр им.
В.А. Алмазова» Минздрава России, а также всоответствиистребованиямиПостановленияГлавногогосударственногосанитарного врача Российской Федерации от 29.08.2014 № 51 «Санитарноэпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержаниюэкспериментально-биологическихклиник(вивариев)»,Руководствапосодержанию и использованию лабораторных животных (США, 2011) иЕвропейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых дляэкспериментальных и других научных целей.Исследование выполнено на 673 самцах крыс Wistar массой 200-280 г(питомник «Рапполово» РАН, Ленинградская область) и на 417 самцах песчанокмонгольских(Merionesunguiculatus)массой60-80г(«Ленинградскийзоологический парк», Санкт-Петербург). Животные содержались в условиях12/12–часового свето-темнового режима при температуре 22 ± 1оС и получалистандартный корм и питьевую воду ad libitum.Животных случайной выборкой распределяли на экспериментальныегруппы. Животных из контрольной и экспериментальных групп ключали вэксперимент одновременно.2.2 Экспериментальные модели ишемического и реперфузионногоповреждения головного мозгаДля решения поставленных задач использовали несколько известныхэкспериментальных моделей ишемического и реперфузионного поврежденияголовного мозга, а именно: модель фокальной ишемии головного мозга у крыс87(Fau S.
et al., 2007), модель хронической церебральной гипоперфузии в остройфазе ишемии мозга (Farkas E. et al., 2007), модель ишемии-реперфузии переднегомозга у монгольских песчанок (Levine S., Payan H., 1966). Также нами быларазработана и запатентована новая экспериментальная модель полной глобальнойишемии головного мозга у крыс.Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введениемхлоралгидрата (Sigma-Aldrich, США) в дозе 450 мг/кг однократно. Всехирургические вмешательства проводили на термостатируемом операционномстоле при температуре тела животного 37,0 ± 0,5°C (TCAT-2LV controller(Physitemp Instruments Inc., США). В послеоперационном периоде до моментавыхода животных из наркоза их температура также поддерживалась напостоянном уровне за счет внешнего источника тепла.2.2.1 Моделирование ишемии-реперфузии переднего мозгау монгольских песчанокУ всех млекопитающих кровоснабжение головного мозга осуществляетсяпосредством двух коллатеральных систем: виллизиева круга (больший объемкровоснабжения) и лептоменингеальных анастомозов.
Животные, имеющиевидовую принадлежность к Meriones unguiculatus, имеют особенность –незамкнутый виллизиев круг, поэтому при окклюзии ОСА кровоснабжениепереднего мозга прекращается и развивается острая ишемия.До начала экспериментов животных в течение нескольких дней приручали крукам. После наркотизации животных фиксировали на спине на поверхноститермостатического операционного стола, механически удаляли шерсть в областипередней поверхности шеи, обрабатывали кожу антисептиком, проводилисрединный разрез кожи, после чего тупым способом разделяли фасции и мышцышеи, обеспечивая доступ в ямку между передним комплексом мышц шеимедиальноигрудинно-ключично-сосцевидноймышцейлатерально.Визуализировали сосудисто-нервный пучок, состоящий из ОСА и волокон88сонного сплетения, после чего тщательно выделяли две ОСА на протяжении 5-6мм.
Под ОСА подводили лигатуры. Глобальную ишемию переднего мозгамоделировали обратимой двусторонней окклюзией ОСА, путем наложениямикрохирургических зажимов на артерии, не затрагивая прилежащих нервныхстволов и сплетений. Длительность ишемии проводилась согласно выбранномупротоколу эксперимента, составляя от 7 до 30 минут, далее операционная ранапослойно ушивалась, реперфузионный период составлял 48 часов или 7 суток.2.2.2 Моделирование фокальной ишемии головного мозга у крысФокальную ишемию головного мозга у крыс моделировали путемпостоянной окклюзии левой СМА в сочетании с 30-минутной окклюзией левойобщей сонной артерии (ЛОСА) (Fau S.
et al., 2007). Постоянную окклюзию левойСМА проводили по общепринятой методике (Самойленкова Н.С. с соавт., 2008;Chen S.T. et al., 1986). Все хирургические манипуляции проводили подстереоскопическиммикроскопомМСП-1(ОАО«ЛОМО»,Россия).Дляобеспечения доступа к левой СМА проводили перевернутый V-образный разрезкожи головы между левым ухом и левым глазом с основанием кожного карманана уровне левого века. После частичного иссечения височной мышцы, припомощи бора в чешуйчатой кости черепа формировали три отверстия диаметром1,5 мм.
Далее осуществляли удаление фрагментов костей черепа, расположенныхмеждуотверстиями.визуализировалиПослетопографиюиссеченияСМА(рис.твердой2.1).мозговойОпределялиоболочкивариантанатомического строение корковой ветви СМА (рис. 2.2).У крыс выделяют три анатомических варианта строения корковой ветвиСМА: магистральный (мСМА), рассыпной (рСМА) и смешанный (сСМА) (HerzR.C. et al., 1996). После определения анатомического варианта строениятерминального отдела СМА проводили необратимую коагуляцию корковой ветвилевой СМА и расположенной рядом вены при помощи электрокоагулятора Фотек89Е-80(«Фотек»,Россия)иодномоментноосуществлялиодностороннююобратимую окклюзию ЛОСА в течение 30 минут.Рис. 2.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
