Диссертация (1144759), страница 29
Текст из файла (страница 29)
6.3). Действие меньшихконцентраций уабаина развивалось несколько медленнее. Так, уабаин в173концентрации 10 нМ к 30 мин вызывал усиление сокращений на ~8 %, однако к60 мин эффект 10 нМ и 100 нМ уабаина становился практически одинаков:усиление сокращений составило 16.4 ± 5.3 % и 15.7 ± 1.7 % соответственно.Усиление сокращений при действии 2 нМ уабаина развивалось медленнее всего истановилось статистически значимым (увеличение на 9.7 ± 2.8 %, р < 0.01) толькок 60 мин опыта.% к исходному значению252015Концентрация0,1 нМ2 нМ10 нМ100 нМ1 мкМ105003060Время, минРис.
6.3. Динамика силы одиночных сокращений диафрагмы крысы (прямаястимуляция) в ходе 1 ч действия уабаина в разных концентрациях. По оси абсцисс– время, мин; по оси ординат – значения силы в процентах к исходному значению(момент 0 мин по оси ординат). Вертикальной стрелкой отмечен моментдобавления уабаина в раствор.Уабаин в концентрации 1 мкМ вызывал небольшой, но статистическизначимый рост силы мышечных сокращений.
Этот эффект был максимальнымчерез ~30 мин действия уабаина (увеличение силы на 12.0 3.9 %, р < 0.05); к 60й мин эффект ослабевал и становился статистически незначимым: увеличениесилы по сравнению с контролем составило 7.7 4.3 % (рис. 6.3).174Параметрыодиночныхсокращений:действиемаринобуфагенина.Одиночные сокращения регистрировали при инкубации мышц в течение 1 ч вфизиологическомрастворемаринобуфагенина(контроль),(концентрацииотили0.05внМрастворедо10сдобавлениемнМ).Эффектмаринобуфагенина оценивали по отношению силы сокращений в присутствииданного агента к таковой в контроле в соответствующие моменты времени. Чтобымаксимально ослабить возможное влияние накапливающегося при сокращениимышц межклеточного калия на связывание маринобуфагенина в низкихконцентрациях применяли однократную стимуляцию мышц 1 раз в 30 мин.Маринобуфагенин, начиная с концентрации 0.05 нМ, вызывал дозозависимое усиление мышечных сокращений.
Максимальное усиление на 14.9 ±2.3 % (р < 0.01) наблюдалось через 1 ч действия 2 нМ маринобуфагенина. Приконцентрации 10 нМ маринобуфагенин также вызывал рост силы сокращений,однако лишь на 6.1 ± 0.7 % (рис. 6.4).% к исходному значению2015Концентрация(нМ)00.050.52101050015304560Время, минРис. 6.4. Динамика силы одиночных сокращений (прямая стимуляция)диафрагмыкрысывходе 1ч действиямаринобуфагенинав разныхконцентрациях.
По оси абсцисс – время, мин; по оси ординат – значенияпараметров в процентах к исходному значению (момент 0 мин по оси ординат).Вертикальной стрелкой отмечен момент добавления маринобуфагенина в раствор.175Зависимость увеличения силы одиночных сокращений от концентрацииуабаина и маринобуфагенина через 1 ч действия показана на рис. 6.5. Этазависимость в обоих случаях имеет колоколо-образную форму. Максимальныйэффект уабаина наблюдался в диапазоне концентраций 10 – 100 нМ. Эффектполностью развивался при концентрации 10 нМ (около 16 %), при этом величинаполовинной эффективной концентрации (EC50) составила 1.2 0.3 нМ.Максимальный эффект маринобуфагенина наблюдался в диапазоне концентрацийУсиление сокращений, %1 – 2 нмоль/л с величиной EC50 для этого диапазона 0.3 0.1 нМ.2520151050010-12-1110010-1010-910-810-710-6Концентрация, МРис.
6.5. Сила одиночных сокращений диафрагмальной мышцы крысы придействии различных концентраций уабаина (темные кружки) и маринобуфагенина(светлые кружки) через 1 ч их действия. Сплошные линии рассчитаны поуравнению Хилла для диапазона концентраций уабаина 0 – 100 нМ, имаринобуфагенина 0 – 2 нМ. По оси абсцисс – концентрация уабаина имаринобуфагенина (М); по оси ординат – значения силы в процентах к таковым вконтрольных опытах (без добавления уабаина или маринобуфагенина).1766.2.2. Изоформ-специфичность действия уабаина и маринобуфагенина наNa,K-АТФазуВданнойчастиработыоценивалиспособностьуабаинаимаринобуфагенина блокировать 2-изоформу Na,K-АТФазы. Ранее былопоказано, что АХ в наномолярном диапазоне концентраций вызывает недеполяризацию, а гиперполяризацию мышечных волокон за счет увеличенияэлектрогенного вклада 2-изоформы Na,K-АТФазы.
Таким образом, зависимостьвеличины гиперполяризующего эффекта АХ от концентрации вещества можетслужитьудобнымэлектрофизиологическимтестомнаегоспособностьблокировать 2-изоформу Na,K-АТФазы (Krivoi et al., 2003).Нервно-мышечные препараты инкубировали в течение 1 ч в растворе,содержащем уабаин в диапазоне концентраций от 1 нМ до 5 мкМ. Далее всоответствующий раствор добавляли АХ в концентрации 100 нМ. Величинублокирующего эффекта уабаина оценивали как разность МПП, измеренногонепосредственно перед добавлением АХ, а затем через 15 мин его действия. Вэтих опытах было установлено, что уабаин блокирует вызываемую АХгиперполяризацию дозо-зависимым образом с IC 50 = 4.9 2.7 нМ (рис.
6.6).СпомощьюмаринобуфагенинаданноготестаблокироватьбылатакжепроверенагиперполяризующийэффектспособностьАХ.Политературным данным известно, что маринобуфагенин является специфическимлигандом 1-изоформы Na,K-АТФазы клеток почек и кровеносных сосудов(Fedorova, Bagrov, 1997; Fedorova et al., 2000). Данные о его влиянии на изоформыNa,K-АТФазыскелетныхмышцвлитературеотсутствуют.Диафрагмальные мышцы инкубировали в растворе с маринобуфагенином вдиапазоне концентраций от 0.5 нМ до 100 нМ в течение 1 ч. Далее, как и впредыдущих опытах, на 15 мин добавляли АХ в концентрации 100 нМ. И в этихопытах было зафиксировано дозо-зависимое блокирование гиперполяризующегоэффекта АХ с IC50 = 2.9 2.0 нМ (рис.
6.6).Изменение МПП, мВ17710-1-2-3-4-5-6010-1010-910-810-710-610-5Концентрация, МРис. 6.6. Зависимость доза-ответ для гиперполяризующего эффекта АХ (100нМ) от концентрации уабаина (темные кружки) и маринобуфагенина (светлыекружки) в диафрагме крысы. Вызываемое изменение МПП соответствуетгиперполяризации. Сплошные линии рассчитаны по уравнению Хилла.Таким образом, наши опыты показали, что уабаин и маринобуфагенинблокируютвызываемуюсоответствующимиАХдиапазонугиперполяризациюконцентраций,сконстантами,усиливающихмышечныесокращения (рис. 6.5), что свидетельствует об участии 2-изоформы Na,KАТФазывреализацииэтихэффектов.Следуетотметить,чтодлямаринобуфагенина положительное инотропное действие и способность всубнаномолярном диапазоне концентраций блокировать 2-изоформу Na,KАТФазы в скелетной мышце крысы показаны впервые.1786.2.3.
Сократительные характеристики при ингибировании 2-изоформыNa,K-АТФазыПараметры одиночных тетанических сокращений. В данной серииопытов изучали эффект полного ингибирования 2-изоформы Na,K-АТФазы 1мкМ уабаина на параметры одиночных тетанических сокращений (частотастимуляции 50 имп/с; длительность стимуляции – 1 с). Регистрировалитетанические сокращения перед добавлением уабаина, а также на 30-й и 60-й минего действия.120максимальная сила сокращенияплощадь тетануса% к контролю115110Уабаин105100950102030405060Время, минРис. 6.7.
Изменение параметров тетанических сокращений (стимуляция 50имп/с в течение 1 с) при ингибировании 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином вконцентрации 1 мкМ. По оси абсцисс – время, мин; по оси ординат – значенияпараметров в процентах к таковым в контрольных опытах (без добавленияуабаина).Как и в опытах с одиночными сокращениями, уабаин вызывал увеличениемаксимальной силы тетанических сокращений, которое на 30 мин составило 10.4179± 4.5 % (р < 0.05); площадь тетануса увеличивалась на 10.0 ± 4.5 % (р < 0.05).Однако на 60-й мин, как и в предыдущих опытах с редкой одиночнойстимуляцией, наблюдалось сходное падение силы, а также площади тетаническихсокращений до 103.7 ± 6.4 % и 104.8 ± 6.1 % от контроля, соответственно (рис.6.7).
Таким образом, положительный инотропный эффект 1 мкМ уабаинаобнаружен нами также и в опытах с тетанической стимуляцией.Динамика утомления: действие уабаина. В этих опытах исследовалидинамику утомления в ходе непрерывного прямого раздражения мышцодиночными стимулами (2 имп/с в течение 5 мин), либо с помощью тетаническойстимуляции (50 имп/с в течение 1 с, каждые 10 с в течение 15 мин). Утомляющуюстимуляциюпроводиличерез1чинкубациимышцвнормальномфизиологическом растворе (контроль) или в растворе с уабаином.При использовании режима ритмической стимуляции 2 имп/с ни для однойиз концентраций уабаина от 1 нМ до 1 мкМ статистически значимых измененийдинамики утомления по сравнению с контрольными мышцами не наблюдали (рис.6.8 А).100% к первому ответу% к первому ответуБА1009080706050806040200400123Время, мин45051015Время, минРис.
6.8 Динамика силы мышечных сокращений в ходе утомляющей прямойстимуляции. А – сила одиночных сокращений (ритмическая стимуляция 2 имп/с) вконтрольных опытах (кружки) и в опытах с применением уабаина вконцентрациях 1 мкМ (треугольники) и 10 нМ (квадраты). Б – максимальная сила180тетанических сокращений (стимуляция 50 имп/с в течение 1 с через каждые 10 с)в контрольных опытах (n = 8) и в опытах с применением уабаина в концентрации1 мкМ (n = 6). По оси абсцисс – время, мин; по оси ординат – сила в % к силепервого сокращения в серии.В опытах с утомлением тетанической стимуляцией ход кривых утомления вконтроле и в присутствии 1 мкМ уабаина также не различался. Утомление в обеихсериях опытов развивалось сходным образом и через 15 мин сила тетаническихсокращений падала до ~20% от исходной (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
