Диссертация (1144759), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследоваливлияние вывешивания на количество белка -субъединиц Na,K-АТФазы исоответствующего уровня мРНК в общем гомогенате m. soleus крысы.Проведенные исследования не выявили изменений количества белка субъединиц Na.K-АТФазы и экспрессии их мРНК через 6 ч разгрузки (рис. 5.11),хотя, как было отмечено выше, электрогенная активность 2-изоформы в этотпериод существенно снижалась (рис.
5.8 А, Б). В период от 12 до 24 ч разгрузкинаблюдалось увеличение количества белка и экспрессии мРНК 2-изоформы вобщем гомогенате мышц. Через 72 ч разгрузки эти параметры начиналивозвращаться к контрольному уровню; количество белка и экспрессия мРНК 1изоформы Na,K-АТФазы в течение всего исследованного периода не изменялись(рис. 5.11 А, Б). Возможно, наблюдаемое увеличение уровня белка и экспрессиимРНК способствует восстановлению электрогенной активности 2-изоформыNa,K-АТФазы в постсинаптическом районе через 12 - 72 ч разгрузки, однако неможетпротиводействоватьустойчивомуснижениювнесинаптическом районе мембраны (рис.
5.8 А, Б).еёактивностиво141100 kD –1100 kD –243 kD –К 6 12 24 72300****2001000К6122472БУровень мРНК, %АУровень белка, %Pan Actin**400**3002001000К6122472Рис. 5.11. Относительное количество белка (А) и относительное содержаниемРНК (Б) 1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы в общем гомогенате m. soleus крыс вконтроле и в период 6 – 72 ч разгрузки. Вверху – примеры соответствующихблотов. Светлые и темные столбцы: 1- и 2-изоформы, соответственно.
**p <0.01 по сравнению с соответствующим контролем. Показывают средние значениядля 8 – 10 мышц (А) и 5 – 16 мышц (Б).Таким образом, снижение электрогенной активности 2-изоформы Na,KAТФазы при функциональной разгрузке не является следствием изменениясодержания белка либо экспрессии мРНК данной изоформы.Локализация2-изоформыNa,K-АТФазывсарколемме.Другойпричиной снижения электрогенной активности 2-изоформы Na,K-АТФазыможет быть нарушение её локализации в сарколемме например, за счет измененийв механизме ее транслокации – обмена между плазматической мембраной и142внутриклеточным пулом (Benziane, Chibalin, 2008).
Для проверки такойвозможности мы провели оценку локализации 2-изоформы Na,K-АТФазы спомощью уабаина, меченного специфической флуоресцентной меткой (Bodipyconjugated ouabain), для оценки локализации нХР использовали -БТХ (см.Методику).В контроле (8 мышц, 57 концевых пластинок) сигналы от меченого -BTX(красный канал, нХР) и Ouabain-Bodipy (зеленый канал, 2-изоформа) былисконцентрированы в области концевой пластинки и совпадали при наложении(рис. 5.12 А).
Такая локализация и уровень флуоресценции 2-изоформы Na,KАТФазы сохранялись через 6 ч (8 мышц, 48 концевых пластинок) и через 12 ч (10мышц, 48 концевых пластинок) разгрузки, что свидетельствует о стабильностилокализации 2-изоформы в постсинаптическом районе сарколеммы (рис. 5.12 Б).Локализация 2-изоформы Na,K-АТФазы во внесинаптической мембранеимела характер упорядоченных рядов в соответствии с ее распределением впоперечных трубочках (Williams et al., 2001). Такой характер распределения этойизоформы Na,K-АТФазы в сарколемме был ранее выявлен и другимиисследователями (Heiny et al., 2010; Radzyukevich et al., 2013). После разгрузкитакая локализация во внесинаптической мембране сохранялась при небольшом,хотя и достоверном росте уровня флуоресценции на 22% (р < 0.05) через 12 чразгрузки (рис.
5.12 Б). Этот результат указывает на увеличение количества 2изоформы во внесинаптической мембране и согласуется с повышеннымсодержанием её белка и мРНК после 12 ч разгрузки.Полученныерезультатыпозволяютпредположитьсуществованиеизбирательного механизма подавления функциональной активности 2-изоформыNa,K-АТФазы в m.
soleus крысы уже в первые часы разгрузки без существенногоизменения ее локализации в сарколемме. Таким образом, наиболее вероятнымобъяснением снижения электрогенной активности 2-изоформыснижение ее каталитической активности.является143Контроль6ч12 чРис. 5.12. А – Локализация 2-изоформы Na,K-АТФазы в сарколемме m.soleus крысы. Красный канал – распределение нХР, меченых -ВТх; зеленый144канал – локализация 2-изоформы (2 NKA), меченой 1 мкМ Bodipy ouabain, вконцевых пластинках; оранжевый цвет – зоны наложения сигналов. Верхний ряд– контрольная мышца; средний и нижний ряды – мышцы после 6 ч и 12 чразгрузки соответственно.
Отдельно внизу показана локализация 2-изоформы вовнесинаптической мембране в виде упорядоченных рядов. Масштаб: 25 мкм. Б –Усредненная флуоресценция от 2-изоформы Na,K-АТФазы в постсинаптическом(1) и внесинаптическом (2) районах сарколеммы. Количество мышц/концевыхпластинок: контроль – 8/57; 6 ч разгрузки – 8/48 и 12 ч разгрузки – 10/48. К –контроль, цифры под осью Х обозначают время разгрузки в ч.
*p < 0.05 посравнению с соответствующим контролем.Чтобы дополнительно проверить, сохраняется ли функциональная 2изоформа Na,K-АТФазы в мембране после двигательной разгрузки, мыиспользовали никотин в концентрации 100 нМ, активирующий данную изоформу,и уабаин в концентрации 1 мкМ, селективно её блокирующий. Эффект активацииизоформы никотином основан на функциональном взаимодействии между нХР сNa,K-АТФазой (см. подробнее главу 3).При действии 100 нМ никотина в контрольных m. soleus крысы вначалеразвивалась деполяризация (р < 0.01) обоих районов сарколеммы, по-видимомублагодаря открыванию небольшого числа нХР. Затем, вслед за деполяризацией,происходило развитие устойчивой гиперполяризации (рис.
5.13 А). Поскольку этагиперполяризация блокировалась 50 нМ уабаина (рис. 5.13 В), она обусловленаактивацией 2-изоформы Na,K-АТФазы.Через 6 ч разгрузки оба участка сарколеммы были исходно деполяризованыпримерно до –70 мВ, однако общая картина действия никотина сохранялась:наблюдалась начальная деполяризация с последующей гиперполяризациеймембраны (рис. 5.13 Б). Как и в контроле, гиперполяризация ингибироваласьуабаином в концентрациях 50 – 100 нМ (рис. 5.13 В). Таким образом, 2-145изоформа Na,K-АТФазы, даже в состоянии подавленной активности послеразгрузки, сохраняет способность повышать свою функциональную активность.Рис. 5.13. Влияние никотина в концентрации 100 нМ на МПП в m. soleusкрысы в контрольных мышцах (А), после 6 ч разгрузки (Б) и через 6 ч разгрузки вприсутствии уабаина (В).
На А и Б – постсинаптический (светлые кружки) ивнесинаптический (темные кружки) районы сарколеммы. Горизонтальная линияобозначает время присутствия 100 нМ никотина в растворе. В – изменение МППво внесинаптическом районе мембраны через 60 мин действия никотина вприсутствии 50 – 100 нМ уабаина (30 мин преинкубации). ** p < 0.01 посравнению с МПП в отсутствие (0 нМ) уабаина. Контроль – 6 мышц, 100 – 130волокон; после 6 ч разгрузки – 8 мышц, 142 – 183 волокна.1465.2.3. Липидная перестройка и 2-изоформа Na,K-АТФазыОпыты с применением в качестве маркера липидных рафтов субъединицы Вхолерного токсина с флуоресцентной меткой (CTхB), показали, что вконтрольных m.
soleus крысы оба сигнала от меченого -BTX (красный канал,нХР) и CTхB (зеленый канал, липидные рафты) локализованы в области концевойпластинки и совпадают при наложении. Такая локализация сохранялась и после 6ч антиортостатического вывешивания (рис. 5.14 А).Рис 5.14. А – Распределение нХР (-БТХ, красный канал) и локализациялипидных рафтов (СТхВ зеленый канал) в концевых пластинках контрольной m.soleus крысы (верхний ряд) и мышцы после 6 ч разгрузки (нижний ряд).Оранжевый цвет – наложение сигналов. Масштаб: 10 мкм.
Б – Усредненнаяфлуоресценция в контрольных мышцах (4 мышцы, 20 постсинаптических и 30внесинаптическихрайонов)ипосле6чразгрузки(4мышцы,20постсинаптических и 39 внесинаптических районов). Черные столбцы –постсинаптический и белые столбцы – внесинаптический районы мембраны. ** р< 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.147Однако даже такая кратковременная разгрузка вызывала дестабилизациюлипидных рафтов (снижение флуоресценции CTхB) в области концевойпластинки, а также во внесинаптической мембране, где нарушения быливыражены слабее (рис. 5.14 Б). Флуоресценция CTxB в постсинаптическом районесарколеммы уменьшалась на 39% (р < 0.01) по сравнению с контролем.
Вовнесинаптическом районе у контрольных крыс флуоресценция CTxB была в трираза ниже, чем в постсинаптическом районе и уменьшалась на 28% (р < 0.01)после разгрузки.Уменьшение флуоресценции CTxB при разгрузке может быть вызвано«оттоком» молекул GM1 из доменов липидного рафта из-за их дезорганизации исвидетельствует о дестабилизации липид-упорядоченной фазы мембраны.
Сцелью визуализации распределения различных липидных фаз плазматическоймембраны мы использовании также флуоресцентные стеролы 22-NBD-холестерини дигидроэргостерола (см. подробнее Методику).Сигнал от -Btx (красный канал) также совпадал с сигналом от 22-NBDхолестерина (зеленый канал) в концевых пластинках контрольных m. soleus итакая локализация сохранялась после 6 ч разгрузки (рис. 5.15 А), при этомфлуоресценция 22-NBD-холестерина была увеличена на 82 ± 12% (р < 0.01) (рис.5.16 А) по сравнению с контролем.
Во внесинаптическом районе исходнаяфлуоресценция22-NBD-холестеринабылав2.5разаниже,чемвпостсинаптическом, однако она тоже возрастала на 96 ± 22% (р < 0.01) через 6 чразгрузки (рис. 5.16 А). 22-NBD-холестерин преимущественно встраивается влипид-неупорядоченную фазу мембраны, его флуоресценция снижается приформировании фаз липидного упорядочения, эти свойства маркера позволяютоценивать изменения текучести мембраны (Loura et al., 2001; Ostašov et al., 2013).Ранее при помощи маркера CTxB было показано, что воздействия, нарушающиеформирование липидных рафтов в нервно-мышечном синапсе мыши, усиливаютфлуоресценцию 22-NBD-холестерина (Kasimov et al., 2015).
В нашем случаенаблюдаемое увеличение флуоресценции 22-NBD-холестерина свидетельствует о148дестабилизации липид-упорядоченной фазы и разрушении липидных рафтов приразгрузке, что подтверждает результаты опытов с CTxB.ББХТ22-NBD–холНаложениеБХТДНЕНаложениеРис. 5.15. Примеры изображений в опытах с применением 22-NBDхолестерина (А) и дигидроэргостерола (Б) в качестве маркеров различныхлипидных фаз плазматической мембраны m. soleus крысы. Метод двойногоокрашивания.
А – Распределение нХР (-БТХ, красный канал) и 22-NBDхолестерина (22-NBD-хол, зеленый канал). Б – Распределение нХР (-БТХ,красный канал) и дигидроэргостерола (ДНЕ, синий канал). На A и Б: Верхниеряды – контрольные мышцы, нижние ряды – мышцы через 6 ч разгрузки.Масштаб – 10 мкм.149Рис.5.16.Опытысприменением22-NBD-холестерина(А)идигидроэргостерола (Б) в качестве маркеров различных липидных фазплазматической мембраны. Показана усредненная флуоресценция в m. soleus(графики слева) и диафрагме (графики справа) контрольных крыс и через 6 чразгрузки.Черныестолбцы–постсинаптическийибелыестолбцы–внесинаптический районы мембраны. A: контроль – 4/4 мышцы, 25/27150постсинаптический и 27/27 внесинаптический районы мембраны; 6 ч разгрузки –5/5мышц, 42/24 постсинаптический и 44/24 внесинаптический районы мембраны.Б: контроль – 4/4 мышцы, 34/26 постсинаптический и 34/27 внесинаптическийрайоны мембраны; 6 ч разгрузки – 5/5 мышц, 49/34 постсинаптический и 49/34внесинаптический районы мембраны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
