Диссертация (1144759), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Показано соотношение количества m.soleus/диафрагма. *р < 0.05; **р < 0.01 по сравнению с соответствующимконтролем.Наблюдаемоестатистическизначимоеснижениефлуоресценциидигидроэргостерола также подтверждает эту интерпретацию (рис. 5.15 Б и 5.16 Б).Дигидроэргостерол предпочтительно ассоциируется с липидными рафтами,поэтому используется в качестве маркера липид-упорядоченной фазы мембраны(Gallegos et al., 2004; McIntosh et al., 2008).
Следовательно, снижениеинтенсивности флуоресценции это маркера свидетельствует о нарушенииструктуры липидных рафтов.Кроме того, нами был проведен аналогичный анализ в постоянносокращающейся диафрагмальной мышце тех же крыс. В диафрагме при разгрузкенаблюдались сходные изменения стабильности липидных рафтов (рис. 5.16 А, Б),что свидетельствует о возможном влиянии системных (циркулирующих)факторов, характерных для данной модели разгрузки.
Однако нарушения быливыражены сильнее в m. soleus, что свидетельствует о важной роли мышечнойразгрузки как таковой. Об этом же свидетельствуют и данные д-ра А.М. Петрова,по которым при продлении разгрузки до 12 ч восстановление липидных рафтов вm. soleus крысы не наблюдается. Однако даже кратковременная двигательнаянагрузка при стимуляции двигательного нерва приводит к их частичномувосстановлению (Petrov et al., 2017).Такимобразом,опытысприменением3-хразличныхмаркеромсвидетельствуют о дестабилизации липидных рафтов в m. soleus крысы прифункциональной разгрузке в течение 6 ч.151Последующие опыты были проведены с целью выявления роли мембранногохолестерина в наблюдаемых нарушениях. Для селективного блокирования 2изоформы Na,K-АТФазы, как и ранее, применяли уабаин в концентрации 1 мкМ(Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010).
Как отмечено выше, в контрольных m.soleus крысы уже через 15 мин действия уабаина наблюдалось снижение уровняфлуоресценции СТхВ, что свидетельствует о дестабилизации липидных рафтов(рис. 3.18). Однако после 6 ч разгрузки, когда 2-изоформа практическиполностью подавлена, уабаин в течение 15 мин действия никак не влиял настабильность рафтов (рис. 5.17 А, Б).Рис. 5.17. Применение комплекса МЦД/холестерин для восстановлениялипидных рафтов в постсинаптическом районе сарколеммы m.
soleus крысы после6 ч разгрузки и блокирования 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1 мкМ). А –Распределение нХР (-ВТХ, красный канал) и липидных рафтов (СТхВ, зеленый152канал), в концевых пластинках после 6 ч разгрузки. Верхний ряд – до добавленияуабаина (0 мин); нижний ряд – через 15 мин действия уабаина. Масштаб: 10 мкм.Б – Динамика флуоресценции СТхВ в течение 15 мин действия уабаина; светлыеи темные символы – внесинаптический и постсинаптический районы мембраны,соответственно. Стрелка – момент добавления уабаина. Изменения показаны поотношению к начальному уровню флуоресценции (1.0).
Количество крыс – 6,мышц – 8. В – Примеры окрашивания липидных рафтов СТхВ (зеленый канал)после 6 ч разгрузки. Масштаб: 10 мкм. Г – усредненная флуоресценция СТхВ. НаВ и Г показаны изображения и флуоресценция после начального окрашиванияСТхВ (СТхВ, светлые столбцы), через 15 мин после добавления уабаина (Oua,светло-серые столбцы); через 15 мин после добавления 5 мМ комплексаМЦД/холестерин (Oua+МЦД/хол, темно-серые столбцы) и после повторногоокрашивания СТхВ (Oua+CTxB, темные столбцы). *** р ˂ 0.001 по сравнению ссоответствующим исходным уровнем СТхВ флуоресценции. Д – Усредненнаяфлуоресценция после начального окрашивания СТхВ (светлые столбцы), через 15мин после добавления уабаина (светло-серые столбцы); через 15 мин послеотмывания нормальным физиологическим раствором (темно-серые столбцы) ипосле повторного окрашивания СТхВ (темные столбцы).
Количество крыс – 4,мышц – 4.Далее присутствие уабаина сохранялось в течение всего эксперимента. Длявстраивания в мембрану экзогенного холестерина мы применяли добавление враствор 5 мМ комплекса МЦД/холестерин (Zidovetzki, Levitan, 2007). Комплексдобавляли в раствор на 15 мин, такая концентрация достаточна для насыщениямембраны холестерином (Kasimov et al., 2015). Данный протокол был использовансцельюпроверить,можетливстраиваниевмембранухолестеринавосстанавливать липидные рафты, нарушенные уабаином и функциональнойразгрузкой.Добавление этого комплекса не влияло на уровень флуоресценции СТхВ,однако после повторного окрашивания СТхВ наблюдалось восстановление153флуоресценции до исходного уровня (рис. 5.17 В, Г).
Это означает, что, несмотряна присутствие уабаина, при добавлении комплексов, содержащих холестерин,происходит образование новых липидных рафтов. Вновь образованные липидныерафты возможно обнаружить лишь при повторном окрашивании. Аналогичноевосстановление наблюдалось и во внесинаптическом районе сарколеммы (непоказано).Полученныевстраиванияэкзогенногоданныесвидетельствуютхолестеринаовосстанавливатьвозможностипутемлипидныерафты,разрушенные ингибированием 2-изоформы Na,K-АТФазы и двигательнойразгрузкой.
Эти данные показывают также, что эффекты уабаина и двигательнойразгрузки в отношении липидных рафтов обусловлены снижением уровня именномембранного холестерина.В части опытов мы применяли кратковременное (15 мин) воздействие 1 мкМуабаина с последующим отмыванием нормальным физиологическим раствором. Вотличие от контрольных m. soleus, где вызванное уабаином нарушение липидныхрафтов было полностью обратимым при отмывании даже без применениякомплекса МЦД/холестерин (глава 3, рис. 3.18), после 6 ч разгрузкивосстановления липидных рафтов при отмывании не наблюдалось (рис.
5.17 Д).Врядеисследованийсообщалось,чтоNa,K-АТФазаподвергаетсяинтернализации при связывании уабаина, и этот процесс продолжается в течениечасов (Kotova et al., 2006; Cherniavsky Lev et al., 2014). Продолжительностьобработки уабаином в данном исследовании (15 мин) слишком коротка, чтобывызывать такие относительно длительные процессы, как интернализация Na,KАТФазы, транслокация или турновер. Проведенное исследование показывает, чтократковременное связывание уабаина с α2-изоформой Na,K-АТФазы являетсядостаточным для индуцирования разрушения липидных рафтов, и этот эффектявляется обратимым после прекращения действия уабаина.
С другой стороны,после 6 ч функциональной разгрузки спонтанного восстановления липидныхрафтов не наблюдается и их восстановление возможно только с помощьювстраивания в мембрану экзогенного холестерина.154Таким образом, уабаин в концентрации 1 мкМ и функциональная разгрузкавызывают сходные нарушения липидной структуры мембраны, которыепредположительно реализуются через общий механизм, заключающийся вугнетении активности α2-изоформы Na,K-АТФазы, и сопровождаются утратоймембранного холестерина. При этом эффекты обоих действующих факторов неаддитивны и, хотя имеют общий механизм их реализации, проявляются поразному.
Эффект уабаина носит обратимый характер, в то время как действиефункциональной разгрузки мышцы более стабильно.5.2.4. Структурная перестройка концевой пластинкиУльтраструктура нервно-мышечного синапса отличается пластичностьюинаходится под постоянным влиянием двигательной активности. Снижениедвигательнойактивностисопровождаетсямногочисленныминарушениямиструктуры концевой пластинки, включая изменение ее площади и усилениефрагментации в распределении нХР. Подобные нарушения наблюдаются последенервации и продолжительной функциональной разгрузки, при возрастныхизменениях, при миодистрофии и других формах мышечной патологии.Молекулярные механизмы, лежащие в основе такой пластичности нервномышечного соединения и концевой пластинки, во многом остаются неясными(Wilson, Deschenes, 2005; Nishimune et al., 2014; Gonzalez-Freire et al., 2014; Rudolfet al., 2014; Tintignac et al., 2015; Rogers, Nishimune, 2017). Наибольший интересвызывает исследование ранних этапов двигательных нарушений, играющихвозможную роль триггеров для последующих сигнальных событий.
В связи сэтим важно, что даже кратковременное снижение двигательной активности m.soleus крысы, как это было описано нами выше, нарушает функционирование 2изоформыNa,K-АТФазы.Приэтомнарушаютсятакжераспределениехолестерина и структура липидных рафтов, играющих, важную роль вкластеризации нХР и стабилизации постсинаптичеческого района сарколеммы(Zhu et al., 2006; Willmann et al., 2006).155Целью данной части работы было исследование структурных изменений вобласти концевой пластинки m.
soleus крысы на ранних этапах (6 – 12 час)двигательной разгрузки. Оценку распределения нХР проводили с помощьюмеченого -бунгаротоксина. Проведенный анализ показал, что в контрольныхмышцах среднее количество фрагментов в одной концевой пластинке составило3.0 ± 0.1. Через 6 и 12 ч разгрузки степень фрагментации концевых пластинок неизменялась, что подтверждается постоянством соответствующих кумулятивныхкривых (рис.
5.18 А-Г). Распределение площадей отдельных фрагментов вконтроле,аппроксимированное3-мянормальнымираспределениями,свидетельствовало о преобладании относительно крупных фрагментов со среднейплощадью 145 ± 10 мкм2. Через 6 и 12 ч разгрузки начинают преобладатьотносительно мелкие фрагменты, крупных фрагментов становится меньше (рис.5.18 Е-З), что согласуется с соответствующим сдвигом кумулятивных кривыхвлево (рис.
5.18 Д).Соответственно, общая площадь каждой концевой пластинки, определяемаякак сумма площадей всех ее фрагментов, через 6 и 12 ч разгрузки в среднемдостоверно (р < 0.01) снижалась на 27 и 40% соответственно (рис. 5.18 И). Этоснижение сопровождалось увеличением относительной флуоресценции нХР наединицу площади (рис. 5.18 К), что может отражать рост плотностираспределения нХР в концевой пластинке и адаптацию к разгрузке.
В результатеинтегральная флуоресценция нХР по всей концевой пластинке, которая быласнижена через 6 ч разгрузки, уже через 12 ч разгрузки не отличалась от контроля(рис. 5.18 Л).Таким образом, кратковременная двигательная разгрузка вызывает не толькофункциональные нарушения 2-изоформы Na,K-АТФазы, снижение уровняхолестерина и дестабилизацию липидной фазы мембраны, но также изменениераспределения нХР и структуры концевой пластинки.156Рис. 5.18.
Структурная перестройка концевых пластинок камбаловидноймышцы крысы при двигательной разгрузке. А-В – Примеры изображенийраспределения нХР, меченых -БТХ (красный канал), в концевых пластинкахконтрольной крысы (А), и крыс через 6 ч (Б) и 12 ч (В) разгрузки. Масштаб: 10157мкм. Г и Д – Кумулятивные кривые, отражающие распределение концевыхпластинок по количеству содержащихся в них фрагментов (Г) и распределениеплощадей отдельных фрагментов (Д): светлые кружки – контроль; красныеквадраты – 6 ч и синие треугольники – 12 ч разгрузки. Е-З – Гистограммыраспределений площадей отдельных фрагментов концевых пластинок в контроле(Е), через 6 ч (Ж) и через 12 ч (З) разгрузки. И-Л – Изменения площади иинтенсивности флуоресценции нХР в мышцах контрольных крыс и крыс через 6 чи 12 ч разгрузки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
