Диссертация (1144759), страница 30
Текст из файла (страница 30)
6.8 Б).Таким образом, в данной серии опытов мы убедились, что даже при полнойблокаде α2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1 мкМ) каких-либо изменений вдинамике утомления при данных частотах стимуляции не происходит. Однако вусловиях более интенсивной активности показано, что при отсутствии гена 2изоформыNa,K-АТФазы(sk2-/-)существенноповышенаутомляемостьскелетной мышцы мыши. Эти данные демонстрируют, что активность 2изоформы Na,K-АТФазы является принципиально необходимой для поддержаниясократительной функции, но эта её особенность проявляется только приинтенсивных режимах сократительной активности (Radzyukevich et al., 2013).Динамикаутомления:действиемаринобуфагенина.Исследовалидинамику утомления мышц в ходе непрерывной ритмической стимуляции (2имп/с в течение 5 мин) через 1 ч их инкубации в физиологическом растворе(контроль)иврастворесдобавлениеммаринобуфагенина.Посколькумаринобуфагенин в концентрациях 1 и 2 нМ вызывал одинаковое усилениесокращений (рис.
6.5), результаты опытов с утомлением в присутствиимаринобуфагенина в этих двух концентрациях были объединены.В этих опытах, в отличие от опытов с уабаином, динамика утомленияразличалась: в присутствии маринобуфагенина падение силы сокращенийпроисходило медленнее, чем в контроле, а также отсутствовало начальноенебольшое увеличение силы сокращений (рис.
6.9). Относительная величина силысокращения (в % к первому ответу) на 30-й секунде стимуляции в контроле (109.7181 2.9 %, n = 9) была статистически значимо (р <0.05) выше, чем в опытах смаринобуфагенином (100.7 1.6 %, n = 9).Для количественного анализа кривых утомления также использовалилинейные участки кривых после 30-й с стимуляции. Линейная аппроксимацияпоказала, что в присутствии маринобуфагенина наклон кривой утомления былстатистически значимо (р < 0.05) меньше, чем в контроле: тангенс угла наклонасоставил соответственно –0.0814 0.0097 (n = 9) и –0.1140 0.0081 (n = 9).120Сила сокращений, %11011009028070260501400100200300400500600NРис. 6.9. Динамика силы сокращений диафрагмы крысы в ходе утомляющейстимуляции с частотой 2 имп/с в контрольных мышцах (1) и в мышцах после 1 чдействия 1 и 2 нМ маринобуфагенина (2).
По оси абсцисс – порядковый номерстимула; по оси ординат – сила сокращений в процентах к силе первогосокращения в серии.6.3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВПоложительное инотропное действие КТС, показанное нами в скелетноймышце, подтверждает предыдущие наблюдения (Yamamoto et al., 1981; He et al.,1822001).Намивпервыесубнаномолярныхпоказано,концентрацияхчтоуабаинусиливаютимаринобуфагенинсокращениявизолированнойдиафрагмы крысы, причем этот эффект реализуется за счет 2-изоформы Na,KАТФазы.
Механизм этого эффекта неизвестен, но, по мнению некоторых авторов,может иметь ту же природу, что и в сердечной мышце (Кривой и др., 2005;Кривой, 2012; He et al., 2001). Предполагается, что основную роль в усилениисокращения гладкой и сердечной мышц при действии уабаина и его эндогенногоаналога2-изоформаиграеткластеризациисNa,K-АТФазыNa+,Са2+-обменником,заSERCA,счетееспецифическойрианодиновымииIP3рецепторами в местах тесного прилегания плазматической мембраны ксаркоплазматическому ретикулуму (обзор: Blaustein et al., 2016).
В скелетноймышце аналогом такой ультраструктуры можно считать триадное соединениемежду Т-тубулами и концевыми цистернами саркоплазматического ретикулума. Вэтом микрокомпартменте локализованы все необходимые для такой регуляциимолекулярные партнеры: дигидропиридиновые и рианодиновые рецепторы,Na+,Са2+-обменник, SERCA (Sacchetto et al., 1996; Berchtold et al., 2000; Fill,Copello, 2002; Altamirano et al., 2014).
Наконец, именно в Т-системе локализованодин из основных пулов 2-изоформы Na,K-АТФазы (Williams et al., 2001;Cougnon et al., 2002; DiFranco et al., 2015).Однако с этой точки зрения трудно объяснить положительный инотропныйэффект наномолярных концентраций уабаина и маринобуфагенина. Известно, чтоконстанта блокирования 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином составляетдесятки мкМ и более (Sweadner, 1995; Blanco, Mercer, 1998; Dobretsov, Stimers,2005; Lingrel, 2010). Это значит, что положительный инотропный эффект уабаинанаблюдается нами при угнетении всего лишь порядка 1% 2-изоформы.Маловероятно, что такое слабое угнетение может приводить к подавлениюэкскреции ионов кальция из клетки через систему Na+,Са2+-обмена по описанномувыше механизму.183Однако, как уже обсуждалось в главе 3 (3.2.1), можно предполагатьсуществование двух пулов 2-изоформы Na,K-АТФазы, обладающих разнымсродством к уабаину (Krivoi et al., 2006). При этом только пул с более высокимсродством (2*, блокируемый уабаином с EC50 ~9 нМ) участвует в вызываемойАХ гиперполяризации за счет функциональной связи с нХР.
Возможно,повышенное сродство к уабаину является одним из следствий взаимодействиямежду этими белками. И здесь важно, как уже отмечалось, что значительный пул2-изоформы Na,K-АТФазы локализована в мембранах Т-системы (Williams et al.,2001; Cougnon et al., 2002; DiFranco et al., 2015). Поскольку по ряду причин(затрудненность диффузии, особенности липидного и молекулярного состава) вкавеолах константа блокирования Na,K-АТФазы уабаином может быть на 3порядка выше по сравнению с некавеолярным пулом (Ferrandi et al., 2004),аналогичную ситуацию можно представить и в отношении Т-системы скелетноймышцы. Этот вопрос, однако, требует специального анализа.Таким образом, механизм положительного инотропного эффекта КТС вскелетной мышце пока остается неясным и можно лишь обсуждать те или иныевозможности.
Тем не менее, наши данные позволяют утверждать, что в скелетноймышце (как в сердечной и гладкой мышцах) этот эффект реализуется при участии2-изоформы Na,K-АТФазы.Нами установлено, что уабаин и маринобуфагенин усиливают сокращениядиафрагмыкрысы,соответствующихдействуяуровнювсубнаномолярныхциркулирующихэндогенныхконцентрациях,аналоговэтихингибиторов Na,K-АТФазы (Lichtstein, Rosen, 2001; Dobretsov, Stimers, 2005;Schoner, Scheiner-Bobis, 2007; Bagrov et al., 2009; Jacobs et al., 2012). При этомэффект реализуется за счет 2-изоформы Na,K-АТФазы, что указывает навозможное участие этой изоформы в регуляции мышечного сокращенияэндогенными КТС. Это предположение подтверждается и другими данными, всоответствии с которыми 2-изоформа может регулироваться циркулирующимиэндогенными дигиталисоподобными лигандами (Radzyukevich et al., 2009).184ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕВ ходе нашей работы был исследован ряд принципиально важных инерешенных до настоящего времени вопросов.Полученныесуществованиинамиданныепозволяютсформулироватьгипотезуофункционального молекулярного комплекса нХР/2Na,K-АТФаза, в котором принципиальным для осуществления взаимодействия этихбелков является конформационный переход нХР в состояние десенситизации.Результатомэтоговзаимодействияявляетсялокальнаягиперполяризациямембраны концевой пластинки, вызываемая наномолярными концентрацияминегидролизованного АХ, которую можно рассматривается как физиологическиймеханизм, препятствующий инактивации Na+ каналов и поддерживающийгарантийный фактор нервно-мышечной передачи.
Таким образом, полученысвидетельства новой роли нХР как модулятора Na,K-АТФазы, не связанной сфункцией нХР как лиганд-управляемого ионного канала. Важно, что подобнаяфункциональная реципрокная связь с Na,K-АТФазой показана и для нХРнейронального типа у насекомых (Bao et al., 2015). Таким образом, предлагаемыйпринцип регуляции за счет функциональной связи нХР с Na,К-АТФазой можетдействовать и в ЦНС, где важнейшей функцией нХР является модуляцияэффективности синаптических связей.Данные о функциональной связи между нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазойпредполагают возможность модуляции Na,K-АТФазы в скелетной мышцециркулирующими холинергическими лигандами.
Известно, что концентрацияникотина, циркулирующего в крови при курении табака, составляет порядка 100нМ (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997). Скелетная мускулатура, содержащаябольшой пул нХР, является потенциальной мишенью циркулирующего никотина,однако лишь в немногих работах изучается влияние курения табака ихронической никотинизации на скелетные мышцы (Larsson, Orlander, 1984;Larsson et al., 1988; Nakatani et al., 2003; Price et al., 2003). Наши данные офункциональной связи между нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы предполагают,185что в условиях хронически действующей низкой концентрации никотина переходчасти нХР в состояние десенситизации может действовать как модулирующийсигнал, вызывающий компенсаторную реакцию в виде изменения экспрессии иактивности Na,K-АТФазы.
Наши опыты с моделированием условий циркуляцииникотина в крови крыс (как при курении табака у человека), показываютспецифичность изменений уровня и функционирования Na,K-АТФазы вотношении её 2-изоформы. Отметим, что специфическое снижение активности иэкспрессии 2-изоформы в условиях хронического введения никотина с помощьюосмотическихмини-помпбылообнаруженотакжевсосудахгемато-энцефалического барьера и в мозге крысы (Wang et al., 1994).Отметим, что применение в клинике антихолинэстеразных препаратов(используемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда нейродегенеративныхрасстройств,миастенииидр.)сопровождаетсяповышениемуровняциркулирующего негидролизованного эндогенного АХ.
Поэтому описанныевыше исследования важны не только для выявления новых механизмовникотиновой интоксикации, но и для более глубокого понимания механизмовпобочных эффектов применяемых антихолинэстеразных препаратов, а также приотравлении такими веществами.На функционирование мембранных белков существенное влияние оказываетлипидное окружение (Levitan et al., 2014), что может быть важным фактороморганизации комплекса нХР/2Na,K-АТФаза. При исследовании возможностифункциональноговзаимодействиямежду2-изоформойNa,K-АТФазыихолестерином нами было установлено, что дестабилизация липид-упорядоченнойфазы сарколеммы, наблюдаемая при действии МЦД, или при селективномблокировании 2-изоформы Na,K-АТФазы 1 мкМ уабаином, имеет сходныйхарактер.
Дестабилизация в обоих случаях обратима при встраивании вплазматическую мембрану экзогенного холестерина, то есть обусловленаснижением уровня мембранного холестерина. С другой стороны, частичноеудаление мембранного холестерина с помощью МЦД специфически снижает186электрогенную активность 2-изоформы Na,K-АТФазы. Наблюдаемые эффектыМЦД и уабаина наиболее выражены в постсинаптической области сарколеммы исопровождаютсяустранениемлокальнойгиперполяризацииэтогорайонамембраны. Полученные результаты позволяют предположить, что в скелетноймышце крысы существует реципрокное взаимодействие между 2-изоформойNa,K-АТФазы и холестерином. Этовзаимодействие можетслужитьфизиологическим механизмом поддержания мышечного электрогенеза и наиболеефункционально значимо в области концевой пластинки (Кравцова и др., 2014;Petrov et al., 2017).При изучении ранних этапов двигательной разгрузки нами установленадаптационный характер изменений экспрессии мРНК и количества 1- и 2изоформ Na,K-АТФазы в камбаловидной мышце крысы, начиная от 6 ч и до 72 чантиортостатического вывешивания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
