Диссертация (1141412), страница 7
Текст из файла (страница 7)
После охлаждения вхолодильникедо0°С,кполученнымрастворамприбавлялирастворкислотыхлористоводородной 15% до значения водородного показателя равного 1 (рН), кислотностьсреды оценивали при помощи универсального индикатора. Последующее определениепроводили аналогично как для холина.В тех же условиях проводили параллельное измерение оптической плотностистандартного образца холина хлорида с солью Рейнеке.Качественное обнаружение аминокислотКачественный анализ аминокислот устанавливали в водных извлечениях при помощиреакции с нингидрином в щелочной среде, а также методом хроматографии на бумаге FN-1 [23,98, 126, 175, 183].
Для этого 0,03-0,05 мл водных извлечений наносили на хроматографическуюбумагу FN-1, которую помещали в хроматографическую камеру, насыщенную парами системырастворителей н-бутанол – кислота уксусная – вода очищенная (4:1:1), с заведомымиаминокислотными образцами. Хроматограммы высушивали на воздухе в течение 1 часа,обрабатывали спиртовым раствором нингидрина 0,2% и помещали на 5-7 минут в сушильныйшкаф, нагретый до температуры 100 – 105°С. Аминокислоты открывались в виде краснофиолетовых пятен [58, 75, 103, 126, 160].Количественное определение аминокислотС целью более детального анализа аминокислотного состава травы кульбабы осенней икульбабы шершавоволосистой исследован качественный и количественный аминокислотныйсостав на аминокислотном анализаторе ААА 339М.
Анализ проводили на базе Испытательногоцентра Института животноводства НААН Украины.С этой целью траву кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой экстрагировалидополногоистощенияхлористоводороднойсырьягорячейконцентрированной.водойочищенной,Полученныеподкисленнойгидролизатыкислотойотфильтровывали,концентрировали при помощи вакуумного компрессора до конечного объема равного 0,5-1 мл,доводили значение водородного показателя (рН) полученной пробы до 2,2. Для определенияобщего содержания аминокислот на аминокислотном анализаторе к 1 мл пробы предварительноприбавляли 1 мл натриево-цитратного буфера с аналогичным значением водородногопоказателя (pH 2,2). Изучение аминокислотного состава осуществляли в типовых дляразделения протеиновых гидролизатов условиях [23, 103,7].Количественное определение аминокислот устанавливали по площадям их пиков.Количественное содержание обнаруженных аминокислот устанавливали, непосредственно в29аликвоте, пошедшей на анализ.
Полученные результаты выражали в наномолях и нанограммах.Суммарное содержание аминокислот рассчитывали в мг/100 мг [198, 199].Для определения связанных аминокислот навески сухого сырья предварительноэкстрагировали спиртом этиловым 80%, а затем пробы заливали водой очищенной иконцентрированной хлористоводородной кислотой, гидролизовали и далее определялисодержание аминокислот по описанной выше методике [198, 200].Концентрациюсвободныхаминокислотрассчитываликакразностьмеждуконцентрацией общего содержания аминокислот и концентрацией связанных аминокислот[200].2.2.4. Анализ дубильных веществКачественное обнаружениеДля определения наличия дубильных веществ использовали водное извлечение дляпроведения качественных реакций [54, 65, 165]:−к 1 мл исследуемого извлечения по каплям прибавляли свежеприготовленныйраствор желатина 1% и раствор кислоты хлористоводородной 10% в равных количествах;−к 5 мл исследуемоего извлечения прибавляли 2-3 мл формальдегида иконцентрированной кислоты хлористоводородной;−к 5 мл исследуемого извлечению прибавляли 1-2 мл раствора воды бромной−к 2 мл исследуемого извлечения прибавляли раствор железо-аммонийных0,5%;квасцов 1%.Количественное определениеКоличественное содержание танинов устанавливали методом перманганатометрическоготитрования в соответствии с ГФ XI [51, 54, 65].
Около 2,0 г (точная навеска) растительногосырья кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой вносили в конические колбы объемом500 мл, прибавляли 250 мл нагретой до кипения воды очищенной, присоединяли к обратномухолодильнику и экстрагировали в течение 30 минут. Колбы охлаждали на воздухе, 100 млохлажденных извлечений процеживали через вату в колбы объемом 250 мл. 25 мл полученныхизвлечений переносили в конические колбы объемом 750 мл, добавляли 500 мл водыочищенной и 25 мл раствора индигосульфокислоты. В качестве титранта использовали растворкалия перманганата (0,02 моль/л), титрование проводили допоявления золотисто-желтого30окрашивания. Контрольный опыт проводили в тех же условиях.2.2.5 Анализ органических кислотИсследование органических кислот методом ГЖХИсследование органических кислот проводили методом газо-жидкостной хроматографиипо методике, используемой для определения жирных кислот [211].Для анализа по 50 мг измельченного воздушно-сухого сырья кульбабы осенней икульбабы шершавоволосистой вносили в виалы «Agilent» объемом 2,0 мл, добавляли по 50,0мкг тридекана растворенного в гексане, используемого в качестве внутреннего стандарта, и по1,0 мл метилирующего агента (ВСl3 растворенного в спирте метиловом, Supelco 3-3033).
Cмесьоставляли в герметично укупоренной виале на 8 часов при температуре 65°С. За это время израстительного материала полностью извлекается жирное масло, происходит его гидролиз насоставляющие жирные кислоты с их одновременным метилированием. Одновременнометилируются свободные органические и фенолкарбоновые кислоты. Затем жидкую фазусливали с растительного сырья, к ней добавляли 1,0 мл воды очищенной. Для экстракцииметиловых эфиров органических кислот использовали дихлорметан.Полученные извлечения анализировали на газо-жидкостном хроматографе AgilentTechnologies 6890, в качестве детектора применяли масс–спектрометрический детектор 5973N.Условия хроматографирования: капиллярная хроматографическая колонка HB-INNOWax(30мх0,25ммх0,15мкм); использование в качестве газа-носителя – гелий, скорость подачи гелия–1,2мл/мин.,объемхроматографическойпробы–2мкл.;скоростьвведенияхроматографической пробы 0,02 мл/с в течение 12 секунд; температура нагревателя вводапробы 250°С.Установление органических кислот проводили, сравнивая полученные результаты сзаведомыми образцами метиловых эфиров и спектров, содержащихся в библиотеке массспектров Nisto5 и Willey 2007 вспомогательными программами для идентификации служилиAMDIS и NIST.
Концентрации индивидуальных органических кислот рассчитывали методомвнутреннего стандарта [211].Количественное определение свободных органических кислотСвободныеорганическиекислотыопределялититриметрическимметодомвсоответствии с ГФ XI [52, 87, 91, 120].По 5,0 г измельченного воздушно-сухого сырья кульбабы осенней и кульбабы31шершавоволосистой помещали в конические колбы объемом 250 мл, вносили по 200 мл водыочищенной и экстрагировали в течение 2 часов на кипящей водяной бане. Колбы охлаждали навоздухе, извлечения количественно переносили в мерные колбы объемом 250 мл, доводиливодой очищенной до метки и перемешивали. 10 мл полученных таким образом извлеченийотбирали и вносили в колбы объемом 500 мл, добавляли по 300 мл свежепрокипяченной водыочищенной, по 2 мл спиртового раствора метиленового синего 0,1% и по 1 мл растворафенолфталеина 1%.В качестве титранта использовали раствор натрия гидроксида (0,1 моль/л), титрованиевели до появления лилово-красного окрашивания.
Содержание органических кислотрассчитывали в процентах в пересчете на кислоту яблочную в абсолютно сухом сырье.2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и разделение природных соединенийВодно-спиртовые извлечения получали из измельченной до 1-2 мм высушенной травыкульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой трёхкратной экстракцией спиртом этиловым70%. Для отделения хлорофилла извлечения объединяли, упаривали до водного остатка подвакуумом, охлаждали, далее проводили фильтрование, после чего фильтрат экстрагировалиорганическими растворителями: хлороформом, этилацетатом, бутанолом.
Водные фазы спиртоводных извлечений помещали в делительные воронки и прибавляли равные объемыхлороформа,смесьвзбалтывали.Послеразделенияслоевхлороформныефракциидекантировали. Данную последовательность проводили 7-8 раз. Хлороформные извлеченияобъединяли. Водные растворы, оставшиеся после экстракции хлороформом, нагревали наводяной бане для выпаривания остатков хлороформа, охлаждали на воздухе и экстрагировалиэтилацетатом указанным выше способом.
После чего водные растворы нагревали на водянойбане для удаления этилацетата, охлаждали на воздухе и экстрагировали бутанолом.Полученные таким образом органические извлечения концентрировали при помощивакуумного компрессора до образования густых сметаноподобных растворов, которыевпоследствии применяли для проведения качественных реакций и хроматографическогоанализа.322.2.7 Анализ кумариновДляустановленияналичиякумариновхлороформныефракцииспирто-водныхизвлечений анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил» вхроматографической системе бензол – хлороформ (1:1). Хроматограммы осматривали в УФсвете после проявления парами аммиака и спиртовым раствором натрия гидроксида 10% [201].2.2.8 Анализ фенолкарбоновых кислотИзучение фенолкарбоновых кислот в траве кульбабы шершавоволосистой и кульбабыосенней проводили в этилацетатных фракциях спирто-водных извлечений и в водныхизвлечениях.Идентификациюпроводилиметодомбумажнойхроматографиивхроматографических системах кислота уксусная 2% и 5%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
