Диссертация (1141412), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Хроматограммы проявляли парамиаммиака и спиртовым раствором хлорида железа (III) 1% и просматривали в УФ свете [40, 56,80, 174].Изучение фенолкарбоновых кислот методом ГЖХИсследованиефенолкарбоновыхкислотпроводилиметодомгазо-жидкостнойхроматографии, используя ту же методику, что и для определения органических кислот [211].Дляустановленияфенолкарбоновыхкислотпроводилисравненияполученныхрезультатов с заведомыми образцами метиловых эфиров и спектров содержащихся вбиблиотеке масс-спектров Nisto5 и Willey 2007.
Вспомогательными программами дляидентификации служили AMDIS и NIST. Концентрации индивидуальных фенолкарбоновыхкислот рассчитывали методом внутреннего стандарта [174, 211].2.2.9 Анализ флавоноидовПрисутствие флавоноидов подтверждали в этилацетатных фракциях и водных остаткахспирто-водных извлечений при помощи следующих качественных реакций:цианидиновой(кисследуемымизвлечениямприбавлялихлористоводородную концентрированную и магниевую стружку) [33, 103];кислоту33цианидиновой по Брианту [33]; в оставшийся после проведения цианидиновой пробыраствор вносили равный объем воды очищенной, прибавляли 1 мл спирта октилового ивзбалтывали. По окрашиванию октанольного слоя судили о природе исследуемых веществ;с раствором алюминия хлорида 2% [103, 138];с раствором хлорида железа (III) [42, 103, 138, 175,207];с раствором натрия гидроокиси 10% [57, 103];с реактивом Фелинга [166, 223].С целью качественного анализа флавоноидов проводили также хроматографию набумаге [43].
Для бумажной хроматографии использовали следующие хроматографическиесистемы: кислота уксусная 30%, н-бутанол – кислота уксусная – вода очищенная (4:1:2) и нбутанол – кислота укскусная – вода очищенная (4:1:5) [65, 76, 81]. Хроматограммыобрабатывали следующими хромогенными реактивами: парами аммиака, спиртовым растворомнатрия гидроксида, раствором циркония хлороксида в метаноле 2% [45, 103, 138], а такжерассматривали в ультрафиолетовом свете.2.2.10 Исследование методом ВЭЖХ фенольных соединенийДля изучения фенольных соединений по 1,0 г (точные навески) сырья кульбабы осеннейи кульбабы шершавоволосистой со степенью измельчения 2 мм помещали в круглодонныеколбы с притертой пробкой вместимостью 100 мл, вносили по 50 мл раствора спиртаметилового 60% и экстрагировали на кипящей водяной бане с обратными холодильниками приперемешивании в течение 15 минут с момента закипания экстрагента в колбах.
Затем пробыобрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, фильтровали через мембранные фильтры сразмером пор 0,45 мкм, количественно переносили в мерные колбы вместимостью 100 мл,доводили объем извлечений до метки спиртом метиловым 60%.Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Agilent 1200 3DLCSystemTechnologies» (США),укомплектованным проточным вакуумным дегазаторомG1322A, четырехканальным насосом градиента низкого давления G13111A, автосамплером(автоматическиминжектором)G1329A,термостатическойколонкойG1316A,диодноматричным G1315С и рефрактометрическим G1362A детекторами.Дляразделенияфенольнихсоединенийиспользовалиобращено-фазовуюхроматографию.
В качестве неподвижной фазы использовали колонку SupelcoDiscoveryC18размером 4,6х250 мм, с размером частиц 5 мкм. Для определения фенольных соединений34использовали две подвижные фазы (подвижные фазы А и В) с градиентным режимомэлюирования. При идентификации различных классов фенольных соединений использовалисоответствующие условия хроматографирования [121].При исследовании гидроксикоричных кислот и кумаринов использовали подвижнуюфазу А, состоящую на 95% из 0,005 н кислоты ортофосфорной и на 5% из ацетонитрила, вкачестве подвижной фазы В был ацетонитрил. Скорость подачи элюента – 0,7 мл/c, давление100 – 120 бар (100–120 кПа), температура термостатической колонки 25° С. Объем пробы 5 мкл,продолжительность анализа 50 минут.
Длина волны 320, 330 нм.Для определения дубильных веществ в качестве подвижной фазы А использоваликислоту трифторуксусную, ацетонитрил 5% и воду pH=2,08. Подвижная фаза B состояла изкислоты трифторуксусной 0,1 % и ацетонитрила. Скорость подачи элюента – 0,1 мл/c, давление400 бар (400 кПа), температура термостатической колонки 25° С. Объем пробы 5 мкл,продолжительность анализа 40 минут. Длина волны 280, 255 нм.Для исследования флавоноидного состава в качестве подвижной фазы А использовалась0,005 н кислота ортофосфорная.
Подвижной фазой B явился ацетонитрил. Скорость подачиэлюента – 0,8 мл/c, давление 156 бар (156 кПа), температура термостатической колонки 25° С.Объем пробы 5 мкл, продолжительность анализа 60 минут. Длина волны 255 нм.Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времениудерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, со временем удерживаниястандартных растворов (РСО). Расчет количественного содержания производили методомабсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «МультиХром для Windows».2.2.11 Анализ тритерпеновых соединенийКачественное обнаружениеПрисутствие в сырье тритерпеновых соединений устанавливали в бутанольныхфракциях спирто-водных извлечений и водных извлечениях с помощью качественных реакций[57, 83, 138, 175]:кспиртовымрастворамконцентрированныхсметанообразныхостатковбутанольных фракций спирто-водных извлечений прибавляли спиртовой раствор холестерина1%;к бутанольным фракциям спирто-водных извлечений прибавляливанилина в кислоте хлористоводородной 1% (реакция Розенталя);раствор35по 2-3 капли водных извлечений помещали в две пробирки.
В первой находилось5 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1 н, а во второй – 5 мл раствора натриягидроксида 0,1 н. Содержание пробирок тщательно взбалтывали. О природе содержащихсясапонинов судили по количеству образовывающийся в пробирках пены.Дополнительно, бутанольные фракции спирто-водных извлечений изучали методомтонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил» в хроматографической системехлороформ – этилацетат (5:1).
Хроматограммы обрабатывали раствором кислоты серной 20%[83].Количественное определениеКоличественноеопределениетритерпеновыхсапониновосуществлялифотоэлектроколориметрическим методом, основанным на определении оптической плотностипосле добавления кислоты серной концентрированной [83].Для этого по 5,0 г (точные навески) измельченного растительного сырья кульбабыосенней и кульбабы шершавоволосистой вносили в колбы объемом 100 мл, заливали 50 млводы очищенной. Колбы присоединяли к обратным холодильникам и экстрагировали накипящей водяной бане в течение 120 минут. Полученные таким образом извлечения из травыкульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой фильтровали в мерные колбы вместимостью50 мл. Объем доводили водой очищенной до конечного и перемешивали.По 5 мл разбавленных извлечений переносили в конические колбы со шлифом объемом100 мл, добавляли 3 мл смеси, состоящей из равных объемов воды очищенной и кислотыхлористоводородной концентрированной.
Колбы присоединяли к обратным холодильникам ипомещали на кипящую водяную баню на 30 минут.Гидролизованные растворы охлаждали под струей холодной воды и переносили вделительные воронки. Колбы промывали 5 мл воды очищенной и переносили смыв также вделительные воронки. Дополнительно в делительные воронки помещали 20 мл смесихлороформа (5 частей) и спирта этилового 96% (1 часть). Содержимое воронки тщательноперемешивали в течение 10 мин. Хлороформные извлечения фильтровали через фильтр,содержащий5 г безводного натрия сульфата, в стеклянную колонку, заполненную2 галюминия оксида.
Данную операцию проводили трижды.Хлороформные фракции упаривали до сухого остатка на водяной бане. Сухие остаткирастворяли в спирте этиловым 70%, раствор переливали в мерные колбы вместимостью 25 мл идоводили спиртом этиловым 70% до номинального объема. К 5 мл такого раствора добавлялиравный объем кислоты серной концентрированной, полученную смесь перемешивали иоставляли на полчаса. После чего проводили измерение оптической плотности окрашенныхрастворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 490 нм. Раствором сравнения служила36вода очищенная.2.2.12 Анализ каротиноидовПриготовление гексановых извлеченийПо 1,0 г воздушно-сухого измельченного сырья кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистой заливали 150 мл гексана и экстрагировали при комнатной температуре втечение 60 минут.Гексановые извлечения упаривали и использовали полученные концентраты дляопределения каротиноидов.Качественное обнаружениеДля обнаружения каротиноидов гексановые экстракты анализировали методомтонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил» в хроматографической системе гексан– ацетон (8:2) [96].Количественное определениеКоличественное содержание каротиноидов в траве кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистой определяли спектрофотометрически [96].
С этой целью по 1,0 г (точныенавески) измельченного воздушно-сухого сырья помещали в конические колбы со шлифомобъемом 100 мл, добавляли по 20 мл гексана и экстрагировали, время от времени перемешивая,при комнатной температуре на протяжении 15 мин. После чего гексановые извлеченияпереносили в мерные колбы объемом 100 мл. Оставшийся шрот заливали новыми порциямигексана первоначального объема, повторяли экстракцию еще дважды.Гексановые извлечения сливали в мерные колбы и доводили гексаном объем дономинального. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометреСФ-2000 при длине волны 453 нм. В качестве раствора сравнения использовали гексан.2.2.13 Исследование жирнокислотного составаИсследование липидных веществ (жирных кислот) проводиди методом газо-жидкостнойхроматографии [211].Для анализа по 50 мг измельченного воздушно-сухого сырья кульбабы осенней и37кульбабы шершавоволосистой вносили в виалы «Agilent» объемом 2,0 мл, добавляли по 50,0мкг тридекана растворенного в гексане, используемого в качестве внутреннего стандарта, и по1,0 мл метилирующего агента (ВСl3, растворенный в спирте метиловым, Supelco 3-3033).Cмесь оставляли в герметично укупоренной виале на 8 часов при температуре 65°С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
