Диссертация (1141412), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Хроматографию проводили с заведомыми образцаминейтральных моносахаров [106, 128, 164]. Изучение кислых моносахаров проводили врастворах Б методом восходящей хроматографии в хроматографической системе этилацетат –кислота уксусная – кислота муравьиная – вода очищенная (18:3:1:4) с достоверными образцамигалактуроновых кислот [26, 28].Количественное определение моносахаридного составаКоличественное определение сахаров в гидролизатах полисахаридных фракцийпроводили после тонкослойной хроматографии денситометрическим методом [62].По 50 мг (точные навески) полисахаридных комплексов кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистойпомещали в ампулы объемом 10 см3, прибавляли по 5 мл растворакислоты серной 0,5 н.
Ампулы запаивали и помещали в сушильный шкаф, разогретый до 100105°С, для проведения гидролиза на 6 часов для ВРПС, 24 часа для ПВ и 48 часов для ГЦ А иГЦ Б.Гидролизаты нейтрализовали бария карбонатом, осадки отфильтровывали черезбумажные фильтры. Фильтраты упаривали на водяной бане до 1 мл и осаждали десятикратнымобъемом спирта этилового 96%. Выпавшие осадки бариевых солей уроновых кислототфильтровывали,промывалиспиртомэтиловым80%.Водно-спиртовыефильтратыобъединяли, упаривали при помощи вакуумного компрессора до сухого остатка.Сухие остатки, растворяли в воде очищенной, количественно переносили в пикнометрывместимостью 5 мл и доводили водой очищенной до номинального объема. Осадки бариевыхсолей уроновых кислот отделяли от фильтров, суспендировали 2,5 мл воды очищенной. Кполученной суспензии добавляли катионит KУ-2 (Н+) до значения водородного показателя (pH)3-4 фиксируемого при помощи универсального индикатора.Растворы фильтровали через бумажные фильтры и упаривали при помощи вакуумногокомпрессора до сухого остатка.
Сухие остатки растворяли в воде очищенной, количественнопереносили в пикнометры вместимостью 5 мл и доводили водой очищенной до номинального43объема.Полученныерастворынаносилимикропипеткойвобъеме0,025млнахроматографические пластинки параллельно с растворами достоверных образцов нейтральныхи кислых моносахаридов.В качестве образцов использовали моносахариды квалификации ЧДА, которые, крометого, трижды перекристаллизовывали из водноспиртовых растворов. Растворы сахаровнаносили микропипеткой и пятна высушивали в токе теплого воздуха.Хроматографирование вели в хроматографической системе н-бутанол – кислотауксусная – вода очищенная (3:1:1).
Хроматограммы высушивали на воздухе в течение 2 часов.В качестве хромогенного реактива использовали анилиндифениламинофосфатный реактив (5частей раствора дифениламина 4% и 1 часть кислоты ортофосфорной концентрированной).Пластинки высушивали на воздухе на протяжении 20 минут и помещали в сушильный шкаф на10 минут. Сахара проявлялись в виде голубовато-зеленых, синих и коричневых зон абсорбциина бесцветном фоне хроматографической пластинки. Концентрацию моносахаридов определялина денситометре Sorbfil (Россия).Количество сахаров в навеске полисахаридных комплексов в процентах вычисляли поформуле: = × ,с × Н × 103(2)где а – количество сахара в мг%, определенное денситометрически;b – общий объем исходного раствора, мл;с – количество раствора, нанесенного на хроматограмму;Н – масса навески полисахаридного комплекса, г;103 – коэффициент пересчета мг в г.Количественное определение функциональных групп пектиновых веществКоличественное содержание функциональных групп пектиновых веществ проводилититрометрически [27, 28].Для определения свободных карбоксильных групп (Кс) по 1,0 г (точные навески) ПВпомещали в колбы со шлифом объемом 300 мл, смачивали спиртом этиловым 96%, чтобыпредотвратить образование комков, вносили по 100 мл воды очищенной, перемешивали иоставляли на ночь для полного растворения пектинов.
После чего добавляли по 6 капельиндикатора Хинтона (водный раствор фенолового красного 0,4%, бромтимолового синего 0,4%,крезолового красного 0,4% и дистиллированной воды в соотношении 3:1:1:1) и титровалираствором натрия гидроксида 0,1 Н до появления не исчезающего в течение минуты красногоокрашивания.44Процентное содержание свободных карбоксильных групп (Кс%) вычисляли по формуле:аКс% = × 0,45,(3)ргде а – количество 0,1 н натрия гидроксида, пошедшее на титрование, мл;р – навеска порошка пектина.Для определения метоксилированных карбоксильных групп (Км) к этим же пробам послеопределения содержания свободных карбоксильных групп добавляли 10 мл (точный объем)раствора натрия гидроксида 0,5 н, колбы закрывали притертыми пробками и оставляли на 2часа для гидролиза метоксильных заместителей карбоксильных групп.
После чего в колбыдобавляли по 10 мл (точный объем) раствора кислоты хлористоводородной 0,5 н. Избытоккислоты оттитровывали раствором натрия гидроксида 0,1 н.Процентное содержание метоксилированных карбоксильных групп (Км%) вычисляли поформуле:Км% =× 0,45,р(4)где b – количество 0,1 н натрия гидроксида, пошедшее на второе титрование, мл;р – навеска порошка пектина.Общееколичествокарбоксильныхгрупп(Ко%)равносуммесвободныхиметоксилированных карбоксильных групп (в процентах):К0% = Кс% + Км%(5)Степень метоксилированности (этерификации) пектинов (λ) находили как отношениесодержания метоксилированных карбоксильных групп к общему количеству карбоксильныхгрупп (в процентах):Км%× 100%(6)К0%Процентное содержание метоксильных групп (СН3О%) вычисляли по титрометрическим =данным [27].31,(7)45где Км – содержание метоксилированных карбоксильных групп в порошке пектина, %;СН3 0 % = Км% ×31 – эквивалентный вес метоксилированных групп;45 – эквивалентный вес карбоксильных групп.452.4 Установление числовых показателей сырьяОпределение влажностиКоличественное содержание в траве кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистойгигроскопической влаги устанавливали методом, изложенным в ГФ XI.
Проводиливысушивание навесок сырья в сушильном шкафу до того момента, когда разница между двумяпоследующими взвешиваниями после получаса высушивания и получаса охлаждения вэксикаторе не превышает 10 мг [51].Определение золыКоличественное определение общей золы в изучаемом сырье проводили по методике,рекомендованной ГФ XI. Для этого сырье сжигали в фарфоровых тиглях. Тигли прокаливали вмуфельной печи до постоянной массы. Таким образом, получали общую золу.Для установления золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10%, кобразовавшейся общей золе добавляли 15 мл кислоты хлористоводородной 10%.
Тигли ссодержимым прокаливали в муфельной печи до постоянной массы [51].Определение экстрактивных веществЭкстрактивные вещества определяли гравиметрически, взвешивая выпарительные чашкис сухими остатками методом, рекомендованным ГФ XI издания. Экстрагентами служили водаочищенная и растворы спирта этилового 96%, 70%, 50% и 30% [51, 95].2.5 Проведение морфолого-анатомических исследованийМорфолого-анатомические исследования проводили на свежем,гербарном, сухом ификсированном в спирте этиловом материале, заготовленном на территории Курской области впериод массового цветения растений в течение 2010-2014 гг. Изучение морфологоанатомического строения сырья «Кульбабы осенней трава» и «Кульбабы шершавоволосистойтрава» проводили методами, рекомендованными ГФ XI [51].
Фото-фиксацию осуществлялипри помощи микроскопа «Биолам С-11» и цифрового фотоаппарата. Фотографии подвергалиобработки с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop CS 6.462.6 Методы токсико-фармакологических исследованийЭкспериментальная работа выполнена на четырех видах животных: беспородных белыхкрысах, беспородных белых мышах, кроликах породы Шиншилла, осенних лягушках RanaTemporarea.
Эксперименты проводили в соответствии с установленными документами "Обутверждении правил лабораторной практики" [137], Good Laboratory Practice for NonclinicalLaboratory Studies (FDA, 21 CFRPart 58, 22.12.1978).2.6.1 Изучение острой токсичностиИзучение острой токсичности проводили по методике Штабского Б.М. [190].Исследования проводили на обоеполых беспородных белых мышах, имеющих массу от 18,0 до20,0 г. Настой травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой, приготовленный всоотношении масса сырья : объем воды очищенной - 1:10, вводили единоразововнутрибрюшинно в интрервале доз от 1 г/кг до 5 г/кг (в пересчете на абсолютно-сухое сырье) вобъемах от 0,2 до 1 мл.
Полисахаридные комплексы, выделенные из травы кульбабы осенней икульбабы шершавоволосистой, растворяли в воде очищенной и вводили в дозах от 100 мг/кг до300 мг/кг. После этого все группы животных (не менее 6 животных) помещали визолированную клетку при стандартном температурном и пищевом режиме и вели наблюдениев течение суток [82, 151, 157, 177].2.6.2 Изучение антиоксидантной активностиОпределение антиоксидантной активности травы кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистой проводили методом, основанным на окислении раствором калияперманганата и извлекаемыми из сырья веществами, обладающими восстановительнымисвойствами [12, 127].Водноеиводно-спиртовыеизвлеченияизкульбабыосеннейикульбабышершавоволосистой готовили в соотношении 1:10, в течение 15 минут нагревали на кипящей47водяной бане, 45 минут охлаждали [52].
В химический стаканчик объемом 50 мл приливали 8 млсвежепрокипяченной и охлажденной воды очищенной, 1 мл раствора кислоты серной 20%, 1 млраствора калия перманганата 0,05 Н. Реакционную смесь перемешивали и титровали измикробюретки (объемом 1 мл с ценой деления 0,01 мл) полученными извлечениями из травыкульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой до исчезновения розовой окраски.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
