Диссертация (1141374), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Проявление зон адсорбциипроводят просматриванием пластинки под ультрафиолетовой лампойSPECTROLINEmodelENF-240C/FE, 230 volts, 50 HZ, 0,17 AMPS (254 нм и365 нм) и затем обрабатывают парами аммиака. Наблюдается зона свечениятемно-оранжевого цвета при 254 нм, окрашивающаяся от ионов аммиака врозово-фиолетовый цвет с Rf0,52 см.ВЭЖХ-хроматография.ВЭЖХ-хроматограммы получают при условиях, описанных в главе II:Ройлевин в количестве 5,5 мг растворяют в 70% этаноле.
Вкалывают 0,4 мкл.Должен появиться пик с временем удерживания 43,927-44,06 мин (горминон)(Рисунок 34). Пик ацетата горминона с временем удерживания 48,007 миндолжен отсутствовать.95Рисунок 34. ВЭЖХ-хроматограмма Ройлевина.1Н ЯМР спектроскопия.В 1Н ЯМР спектре, полученном на приборе44,051Gemini 200 (200МГц), в CDCl3(0,005 г в 0,6 мл) должны присутствовать следующиехарактеристические сигналы горминона: 4,72 м.д., мультиплет, Н-7; 3,12 м.д.,септет, -СН-(СН3)2; 2,65 и 2,75 м.д., мультиплет, Н-1; 0,92 и 0,95 м.д.,синглеты, 2СН3- группы; 1,18 – 1,23 м.д., два перекрывающихся дублетаи один синглет, 3 СН3-группы, как представлено на Рисунке 35.УФ-спектроскопия.УФ спектр, полученный на приборе CARY 100 SCANс диапазономдлин волн от 200 до 800 нм в 96% этаноле в концентрации 0,003%, должениметь максимум поглощения 273 нм.96Рисунок 35.
1Н ЯМР спектр Ройлевина (0,005 г субстанции в 0,6 мл CDCl3).5.2. Разработка методик количественного определения 7гидроксиройлеанона (горминона) в Ройлевине для постадийногоконтроля при получении субстанции5.2.1. Разработка методики количественного определения 7гидроксиройлеанона (горминона) в РойлевинеИзвестные ранее в литературе методы количественного определенияройлеаноновбылиоснованынапрямойспектрофотометрииилихроматоспектрофотометрии [3,34,48]. При этом проводилось определениесодержания суммы двух основных компонентов корней шалфея – горминонаи ацетилгорминона в пересчете на горминон.
В нашей работе проводилосьопределение содержания непосредственно горминона.97Для решения поставленной задачи нами был также выбран методпрямойспектрофотометрии.Посколькуединственнымбиологическиактивным веществом всубстанции, а также поглощающим в УФ-области притой же длине волны, что и Ройлевин, является 7-гидроксиройлеанон(горминон), то последний и был выбран в качестве стандарта. Былразработан способ получения горминона и ТУ на горминон стандарт.5.2.1.1.
Разработка метода получения горминона СО и оценка егокачестваГорминонСО получают по методике, сущность которой заключается вследующем: субстанцию антимикробного действия Ройлевин, полученный изкорней шалфея лекарственного, хроматографируют на колонке с силикагелем40/100 μ в соотношении 1:40-1:60. В качестве элюента используется смесьгексан-хлороформ с увеличением градиента последнего. Контроль засхождением с колонки целевого продукта осуществляется визуально(горминон имеет окрашенную в желто-оранжевый цвет зону) и с помощьюТСХ на пластинах силуфола, где зона адсорбции горминона окрашивается вфиолетовый цвет в парах аммиака. Отбирают фракции, содержащие толькогорминон. Элюат упаривают, технический продукт кристаллизуют из 90оэтанола.
При необходимости делают дополнительную перекристаллизацию[15].Внешний вид. Желтые или желто-оранжевые блестящие кристаллыРастворимость. Растворим в спирте, хорошо растворим в хлороформе.Подлинность. Для определения подлинности и чистоты предлагаютсякачественная реакция в растворе,1НЯМР спектр, УФ-спектр и ВЭЖХхроматограмма.Качественная реакция.Раствор горминона в спирте в присутствиищелочи окрашивается в сиренево-фиолетовый цвет.1НЯМРспектр. Горминон дает сигналы в области 0 – 7.5м.д.Мультиплет при 4.73 м.д., W1/27 Гц относится к экваториальному α-протону98при С-7, септет при 3.15 м.д., 7 Гц обусловлен метиновым протономизопропильной группы. При записи спектра на приборе с частотой 200 МГц врастворе хлороформа дублеты метильных групп изопропильного фрагментаи синглет СН3-группы при С-10 (Н-20) вследствие близости химическихсдвигов хорошо разрешаются лишь при дополнительной развертке.
Синглеты0.91 и 0.98 м.д. принадлежат СН3-группам при С-4 (Н-18, Н-19). Синглет при7.27 м.д. и уширенный синглет при 3.05 м.д. принадлежат гидроксильнымОН-группам при С-12 и С-7 соответственно.УФ-спектр.В области длин волн от 190 до 360 нм имеетмаксимумпоглощения при 2732нм (Рисунок36).Рисунок 36. УФ-спектр горминона.ВЭЖХ. В качестве критерия подлинности применяется также значениевремени удерживания горминона в 70% спирте в описанных в главе IIусловиях. Время удерживания горминона составляет 43,9-44,06 мин.99Удельный показатель поглощения А1см В качестве количественной1%характеристикигорминонаСОиспользуетсяудельныйпоказатель1%А1смпоглощенияв спирте этиловом 96% при длине волны 273±2нм равный395. Значение А1см получено при измерении оптической плотности 4 образцов,1%взято среднее значение.УФ-спектр необходимо снимать в перегнанном 96%этаноле, т.к.
при наличии щелочного агента возможна ионизация горминона,чтоуменьшаетоптическуюплотность,соответственноудельныйкоэффициент поглощения.Температураплавления. Определение температуры плавления проводятна столике Боетиуса согласно инструкции к прибору.
СО горминона должениметь tплавления 178-181 оС с интервалом 1-2 оС.Посторонние примеси. Для определения посторонних примесейиспользуется метод ВЭЖХ. В качестве примеси к горминону может быть егоэпимер по С-7, таксохинон. УФ-спектры 7α-гидроксиройлеанона (горминона)и 7β-гидроксиройлеанона (таксохинона) практически одинаковы, поэтомуделается допуск содержания последнего в СО не более 5%.Потерямассыпривысушиваниинеприводится,т.к.передиспользованием образец рекомендуется высушивать при 100 – 102 °С втечение 4 часов, что гарантирует полную потерю влаги образцом.5.2.1.2.
Методика количественного определения горминона вРойлевинеПосколькувпрепаратеРойлевинприсутствуеттолькооднопоглощающее в УФ области вещество, горминон, то измерение УФ спектрараствора Ройлевина проводится без дополнительной обработки.Анализ готового продуктаМетодика проведения анализа: в мерную колбу вместимостью 25 млпомещают 0,02 г субстанции Ройлевина, прибавляют 10 мл спирта этилового10096%, перемешивают до полного растворения и доводят до метки этим жерастворителем (раствор А). Затем в мерную колбу вместимостью 25 млприливают 1 мл раствора А и доводят до метки спиртом этиловым 96%(раствор Б).Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре вкювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 273 нм.
В качестве растворасравнения используют спирт этиловый 96%.Содержание горминона в процентах в пересчете на абсолютно сухуюсубстанцию Ройлевина рассчитывают по формуле:ХD 25 25 100%m 1 A11см (100 W ) , гдеD – оптическая плотность испытуемого раствора;1%А1см- удельный показатель поглощения 7-гидроксиройлеанона (горминона)равен 395;m – масса Ройлевина, взятого на анализ, г;W – потеря в массе при высушивании очищенного экстракта, %.Валидационная оценка методики количественного определениягорминонавРойлевинепроводиласьпоследующимпоказателям:специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторнаяпрецизионность.Специфичность. Проверка соответствия максимума поглощенияспектра раствора Ройлевина в спирте этиловом 96 % и СО 7гидроксиройлеанона(горминона),полученныхнарегистрирующемспектрофотометре в диапазоне длин волн 240-340 нм.УФ-спектр Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корнейшалфея лекарственного в диапазоне длин волн от 240 до 340 нм имеетмаксимум поглощения при длине волны 273±2 нм.
Аналогичный максимумпоглощения имеет спектр раствора стандартного образца горминона(Рисунок 37).101Рисунок 37. УФ-спектры, Ройлевина,субстанции антимикробного действияиз корней шалфея лекарственного в 96 % спирте этиловом (1), СО горминонав 96 % спирте этиловом (2).Линейность.
Около 0,005 г (точная навеска) СО горминона помещаютв мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 96%, перемешивают и объем раствора доводят этим же спиртом до метки, 1 млполученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл иобъем раствора доводят до метки спиртом этиловым 96 %, перемешивают.Раствор используют свежеприготовленным.Определение линейности проводилось на 8 уровнях концентраций СОгорминона в диапазоне 4 – 27,2 мкг/мл (Таблица 17, Рисунок 38).Таблица 17Результаты испытания№ измерения12345678КонцентрацияСО (горминон), мкг/мл4,08,010,213,615,619,222,427,2Аналитический(оптическая плотность)0,1510,3050,3780,5070,580,7260,8521,046отклик102Концентрация СО горминона,мкг/млЗависимость концентрации СО горминонаот его оптической плотности302826242220181614121086420y = 25,974197x + 0,268409R² = 0,999412Зависимостьконцентрации СОгорминона от егооптической плотности0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1Линейная (Зависимостьконцентрации СОгорминона от егооптической плотности)Оптическая плотностьРисунок 38.
Зависимость оптической плотности раствора горминона от егоконцентрации.Коэффициент корреляции составил 0,9994, что соответствует критериюприемлемости линейности.Правильность.Модельные смеси готовили трех концентраций ссодержанием СО горминона 25, 50, 75 % к ее исходной концентрации вспиртовом растворе Ройлевина (Таблица 18).Таблица 18Результаты испытания№п/пНайдено, мгДобавленоОжидаемоеПолученноеАбсолютнаяСО, мгзначение, мгзначение, мгошибка,мг9,4211,2213,129,7911,5913,499,6811,4813,389,3611,0312,919,6811,6313,339,7511,4313,6199,560,060,190,210,11-0,040,16-0,070,05-0,231.1 7,521,92.1 7,523,73.1 7,525,61.2 7,891,92.2 7,893,73.2 7,895,61.3 7,781,92.3 7,783,73.3 7,785,6Среднее значение выхода, %Выход, %99,3698,3098,3998,87100,3498,81100,799,56101,7103Показано, что процент восстановления находится в пределах от 98,30% до 101,7 % и имеет среднее значение 99,56 %, что соответствуеттребованиям критерия приемлемости.Внутрилабораторная прецизионность.Сходимостьметодики.Определениепроцентногосодержаниягорминона в 6 повторностях образца Ройлевина, субстанции антимикробногодействия из корней шалфея лекарственного, выполнялось одним аналитикомпри одних и тех же условиях (реактивы, оборудование, обстановка и др.), втечение короткого промежутка времени (Таблица 19).Таблица 19Результаты испытания№Содержание 7-гидроксиройлеанонаиспытания аналите, %139,11238,27338,09438,35538,01638,14Среднеезначение содержания, %38,5S , % (единица измерения испытаний)0,503CV, %1,31ε,%1,4(горминона)вКоэффициент вариации для 6 измерений имеет значение 1,31, чтосоответствует требованиям критерия приемлемости.Воспроизводимостьметодики.Определениевнутрилабораторнойвоспроизводимости методики проводили 2 аналитика на 9 повторностяхобразца Ройлевина, субстанции антимикробного действия из корней шалфеялекарственного, приготовленных независимо друг от друга (Таблица 20).104Таблица 20Результаты испытанияОбразец123456789Среднее значение содержания, %S, %CV, %DАналитик 136,3936,2336,2335,5336,3135,8235,8235,4435,9835,970,11830,33Критерий Фишера F (95%, f1=8, f2=8) =3,44Аналитик 237,1337,1436,6336,3937,2436,3136,4736,3536,7936,760,11730,321,01Для определения числового показателя содержания горминона вРойлевине было протестировано 11 образцов субстанции на антимикробнуюактивность в отношении золотистого стафилококка (Таблица 21).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
