Диссертация (1141374), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Мультиплетность сигнала Н-3 (дублет 3,07 м.д.,J=9,6 Гц) указывает на наличие второй кислородной функции при С-2. Спинспиновое взаимодействие между Н-2 и Н-3 показано также наличием кросспиков 3,79/3,07 м.д. в спектре H,H COSY. Значение КССВ в сигнале Н-2(секстет, 3,79 м.д., J1=11,4 Гц, J2=9,6 Гц, J3=4,3 Гц) свидетельствует о 2α, 3βконфигурации протонов при С-2 и С-3 (Таблица 8).66Таблица 8Сравнительные данные 1Н ЯМР спектров ХI и литературныхданныхдля торментоловой и маслиновой кислотс конфигурацией гидроксигрупп 2α3βПоложениепротона2αТорментоловая кислота2α, 3β(d6-метанол) [117]3.64 м.д., ддд, 11.0 Гц,МаслиноваяХI (d6-метанол)кислота 2α, 3β(d5-пиридин) [46]4.02 м.д., секстет, (9.0 3.79 м.д., секстет,10.0 Гц, 3.0 Гц [117]Гц, 9.0 Гц, 4.0 Гц [46]3.63 м.д., ддд, 11.2Гц; 9.611,4 Гц, 9.6 Гц, 4.3ГцГц, 4.5 Гц [81]3β2.92 м.д., д[117]3.35 м.д., д, 9.0 Гц3.07 м.д., д, 9.6 Гц2.92 м.д., д, 9.6 Гц [81]Три кислородные функции из 5 присутствуют во фрагменте, состоящемиз колец D, E.
Одна из кислородных функций по биогенетическимсоображениямкарбоксильная группа при С-17. Наличие карбоксильнойгруппы подтверждается фрагментацией молекулы XI под действиемэлектронного удара, а именно отцеплением m/z 45 (СООН) от иона, дающегопик m/z 248 (циклы D, E) и образованием пика m/z 203.
В 1Н ЯМР спектреприсутствуют сигналы только 7 метильных групп и отсутствуют сигналыпротонов продукта промежуточного окисления метильной группы (НСО,СН2ОН). В 1Н ЯМР спектре присутствуют дублеты 4,05 м.д. и 3,35 м.д.,КССВ11,2Гцобусловленныетранс-диаксиальнымипротонамиизолированной группировки –СНОН-СНОН-. Взаимодействие протоновследует из наличия кросс-пиков 4,05/3,35 в Н,Н СOSY (Рисунок 27).
Такаягруппировка может быть в цикле Е: С(21)НОН-С(22)НОН или в цикле D:С(15)НОН-С(16)НОН.Выбор в пользу первого варианта сделан на основе следующихсоображений. При наличии ОН-групп в цикле D при С-15 и С-16 или толькопри С-16 синглетный сигнал СН3-27 в1Н ЯМР спектре (d5-пиридин)67присутствует в области 1,78-1,85 м.д. [83]. При отсутствии замещения С-15 иС-16 метильная группа СН3-27 дает сигнал при 1,65 м.д. (торментоловаякислота). Сигнал СН3-27 вещества XI расположен при 1,58 м.д., чтосогласуется с отсутствием замещения в цикле D.Рисунок 27.
Спектр Н,Н СOSY вещества XIв CD3OD.Таким образом, для вещества XI наиболее вероятна структура 2α, 21β,22α- тригидроксиолеаноловой кислоты (Рисунок 28).Рисунок 28. Структурная формула 2α, 21β, 22α –тригидроксиолеаноловойкислоты.683.2.3. Биологическая активность петнациклических тритерпеноидовОлеаноловая и урсоловая кислоты по данным работы [82] обладаютантимикробнойактивностьюустойчивыхнекоторымквотношенииантибиотикам,рядамикроорганизмов,применяемымвмедицине(ванкомицин, метициллин). Они активны в отношении энтерококков истафилококков, E.
faecium, E. faecalis, S. pneumoniae, S. Aureus и успешноприменяются в Китае для лечения заболеваний печени [82].В лаборатории микробиологических исследований ВИЛАР былопроведено сравнительное изучение антимикробной активности урсоловойкислоты и продуктов ее окисления хромовой кислотой, перманганатом калияв разных средах. Работа проведена в отделе химии ВИЛР [25,26]. Былиполучены соединения, показанные на Рисунке 29.Рисунок 29.
Iа:R=OH,H, R’=2H; Iб:R=O, R’=2H; Iв:R=R’=O; Iг:R=OAc,H, R’=2H;Iд:R=OAc,H, R’=O; Iж:R=NOH, R’=2H; Iз:R=OH,H, R’=O; IIа:R=OH,H; IIб:R=O.Исходное соединение, т.е. урсоловая кислота, подавляло рост только St.aureus250 мгк/мл. Такую же активность показали соединения Iа,в,ж,з иIIб. Вслучае грамотрицательных микроорганизмов бактериостатический эффектменее выражен (500 и 1000 мкг/мл).
Образование в молекуле лактонногоцикла (IIа) приводит к появлению антифунгинальных свойств (250мкг/мл вотношении M. canis). В нашем случае в лаборатории микробиологических69исследованийбылопроведеносопоставление бактериостатическойифунгистатической активности олеаноловой и урсоловой кислот.В результатеизучения установлено (Таблица 9), что урсоловая и олеаноловая кислотыобладаютбактериостатическойграмположительногоактивностьюмикроорганизма‒вотношениизолотистогостафилококка(Staphylococcus aureus 209-P) в концентрации 125-250 мкг/мл и в отношенииграмотрицательныхбактерий‒синегнойныхбактерий(Pseudomonasaeruginosa АТСС 9027) в концентрации 1000 мкг/мл.В отношениикишечной палочки (Esherichia coli АТСС 25922), вульгарного протея (Proteusvulgaris ATCC 6896), а также в отношении дрожжеподобных грибов (Candidaalbicans АТСС 10231) и мицелиальных грибов (Microsporum canis 3/84) ‒ неактивны в изученной концентрации (1000 мкг/мл).Интерес представляетсравнениеактивностиРойлевинаигорминонавотношенииграмотрицательного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027(нет активности при 1000 мкг/мл для горминона, 1000-500 мкг/мл дляРойлевина при содержании горминона 53-57% и 500 мкг/мл при содержаниигорминона 37,5%), т.е.
активность увеличивается с ростом содержаниятритерпенов. Активность в отношении грамотрицательных микроорганизмовтемболееценна,т.к.оченьнемногиеприродныесоединенияиантимикробные препараты ею обладают.Таблица 9Антимикробная активность урсоловой, олеаноловой кислот, субстанцийУрсоловая кислота125--Олеаноловая кислота125--Субст.эвкалимина7,815,67,815007,8Субст. сангвиритрина1000част.1000част.1000100025025031,2Microsporum canis352Название веществаили препаратаStaphylococcusaureus 209PEscherichia coliATCC25922ProteusvulgarisATCC6896PseudomonasaeruginosaATCC9027CandidaalbicansATCC10231эвкалимина и сангвиритрина----62,51000 част.50031,270Так эффективный антимикробный препарат Сангвиритрин, состоящийиз четвертичных солей алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, обладает вотношении отрицательного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa весьмаумеренной активностью 250 мкг/мл.
Субстанция эвкалимина (активноеначало эуглобали) в отношении указанного микроорганизма проявляет оченьслабую активность 1000 мкг/мл.71Выводы к Главе III1. Изученхимическийсоставройлеаноноввкорняхшалфеялекарственного. Подтверждено наличие трех ранее известных веществ:ройлеанона, горминона и ацетилгорминона. Впервые обнаружены ивыделены 7-оксоройлеанон, таксохинон и 6,7-дегидроройлеанон.2. Изучен химический состав тритерпенов, сопутствующих ройлеанонамв препарате.Показано наличие ранее известных олеаноловой иурсоловойкислот.Впервыевыделеныэускафиковая,19-дезоксиэускафиковая и 2α, 21β, 22α-тригидроксиолеаноловая кислоты.Последнее соединение является новым. Для него установленостроение.3. Отмечена связь между строением молекулы ройлеанонов и степеньюихантимикробнойактивности.Наличиегидроксигруппыв7положении увеличивает активность (15,6 мкг/мл), ацилирование ОНгруппы (31,2 мкг/мл) и ее окисление до оксогруппы (62,5 мкг/мл)уменьшает, дегидратация приводит к практическому исчезновениюактивности (1000 мкг/мл).
Наличие оксогруппы при С-7 вызываетпоявление значительной фунгистатической активности (62,5 мкг/мл вотношении M. canis).4. В ходе изучения строения выделенных ройлеанонов с помощью массспектрометрии обнаружена закономерность распада молекулы придействии мягкой ионизации (электронный спрей EMS): разрыв кольцаА по связи С1-С10 или С4-С5 с последующим отщеплением алкильныхгрупп от линейной цепочки.5.
Методом ВЭЖХ, подтверждена нативность всех выделенных из корнейшалфея ройлеанонов.6. Показано,чтотритерпены,сопутствующиеответственнымзаантимикробную активность Ройлевина ройлеанонам, проявляют такжеантимикробную активность.72Глава IV. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИАНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ РОЙЛЕВИНДля решения поставленной задачи необходимо было выполнитьследующуюработу:1. Изучить состав ройлеанонов в корнях шалфея лекарственного исопоставить их антимикробную активность;2.
Изучить природу сопутствующих веществ, строение молекул ивозможность их вклада в антимикробную активность;3. Изучить возможность трансформации ацетилгорминона в болееактивный горминон в результате щелочного гидролиза. Доказатьстабильность горминона в щелочной среде. Изучить характер искорость реакции гидролиза 7-ацетоксигорминона в щелочнойсреде;4. РазработатьлабораторныйрегламентполученияРойлевина.Провести оптимизацию параметров экстракции сырья;5.
Разработать метод количественного определения горминона всырье, субстанции Ройлевини для постадийного контроляпроизводства препарата.Решению 1й и 2й задач посвящена III Глава диссертации. В даннойглаве описывается процесс решения последующих (3-5) задач.Ранее из корней шалфея лекарственного в 70-х годах 20 столетия вВИЛАР был разработан препарат антимикробного действия, которыйпредполагалось использовать только как полуфабрикат для получениялекарственных форм. Антимикробная активность обуславливалась суммойгорминона и ацетоксигорминона, соотношение которых колеблется от 2:8 до8:2[29].Технологическая схема получения этого препарата следующая:1.
экстракция измельченного сырья 70% изопропиловым спиртом;732. упаривание изопропиловых экстрактов;3. экстракция водного кубового остатка петролейным эфиром(примерно, семикратная);4. упаривание петролейноэфирных экстрактов;5. выдерживание сгущенного петролейноэфирного раствора вхолодильнике (~ 3 суток). В случае получения смолистогопродукта кристаллизацию повторяют;6. сушка, измельчение готового продукта.В качестве сопутствующих ройлеанонам веществ в препаратеприсутствуют малополярные соединения липидного характера, насыщенныеуглеводороды с молекулярной массой свыше 400 типа нонакозана.Нами был разработан способ полученияантимикробной субстанции изкорней шалфея лекарственного на принципиально иной технологическойоснове. В качестве антимикробного начала присутствует индивидуальноесоединение, наиболее активный ройлеанон горминон (его активность вотношении золотистого стафилококка 15,6 мкг/мл, ацетоксигорминона 62,5мкг/мл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
