Диссертация (1141374), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Объем фракций20 мл. Из 4-6 фракций выделено вещество I (6 мг), из 19-22 фракцийвещество II (150 мг) и вещество III (333 мг), из 24-27 фракций вещество IV(18мг) (Рисунок 17).Продукт из 19-22 фракций содержал смесь веществII (~80%) и III(~20%). Разделение осуществлено дробной кристаллизацией из спирта.Остаток фракций 19-22 после удаления элюента (0,6 г) растворили в 30 млспирта этилового 96о. При стоянии (to комн., 24 часа) выпал осадок II. Изматочникавхолодильнойкамере(2суток)выпаловеществоIII.Перекристаллизация I, II осуществлена из спирта, III, IV из водного спирта.Рисунок 17.
Структурные формулы веществ I, II, III, IV.503.1.4. Идентификация ройлеанонов. Сопоставление антимикробнойактивности выделенных ройлеаноновВеществаI-IVидентифицированыпритемпературеплавления,идентичности хроматографического поведения с аутентичными образцами наТСХ в системе 100% хлороформ и по данным1Н ЯМР спектра сройлеаноном, 7-ацетоксигорминоном, 7-гидроксиройлеаноном (горминоном),и 7-оксоройлеаноном соответственно (Таблица4).Таблица 4Параметры сигналов 1Н ЯМР спектра ройлеаноновПараметрысигналовОтнесенияН-1Н-5СоединенияI (CDCL3)ройлеанонт.пл.
1791810С2,71 м; 2,73мН-6Н-7Н-15Н-16Н-17Н-18Н-19Н-20ОНСН3СО3,15 спт (7 Гц)1,18 д (7 Гц)1,21д (7 Гц)0,89 с0,93 с1,25 с7,25 сII (CDCL3)7-ацетоксиройлеанонт.пл. 212-2140С2,75 м; 2,82 мIII (CDCL3)7-гидроксиройлеанон(горминон)Т.пл. 177-178 0С2,66 м; 2,76мIV (CDCL3)7-оксоройлеанон т.пл.198200 0С (лит. 214215 0С2,89м; 2,83м1,82 дд (13,5 Гц;4,5 Гц)1,93м; 1,73м1,51м; 1,61м2,67дд (18,2Гц;4,5Гц)2,49дд (18,2 Гц;13,5 Гц)5,81 м3,15 спт (7 Гц)1,18 д (7 Гц)1,25д (7 Гц)0,92 с0,95 с1,30 с7,14 с2,02 с4,73 м3,15 спт(7Гц)1,19 д (7 Гц)1,22 д (7 Гц)0,98 с0,98 с1,25 с3,18 спт (7 Гц)1,21 д (7 Гц)1,25д (7Гц)0,92 с0,98 с1,35 с7,05 сРойлеанон был выделен в виде красных кристаллов (из спирта),горминон – в виде золотисто-желтых и темно-оранжевых кристаллов (из 70оспирта) с одинаковыми температурами плавления для обеих модификаций и1Н ЯМР спектрами.
Ранее в литературе сообщалось о двух модификацияхкристаллов (желтых и красных) только для ройлеанона [74]. В корнях51шалфея лекарственного в следовых количествах содержится стереоизомергорминона, таксохинон, с аксиальной ориентацией Н-7. О наличиитаксохинонавнеперекристаллизованномгорминонесвидетельствуютхарактеристические сигналы дублет 3,8 м.д., J=2,2 Гц (7-ОН акс.) и квартетдублетов 2,19 м.д., Jгем=12,7 Гц, J6a,7a=7,3 Гц (Н6а) (Рисунок 18). Стабильныйхимический сдвиг 7-ОН и спин-спиновое взаимодействие с Н-7 (Рисунок 19)могут быть связаны с влиянием карбонильного кислорода при С-14.Действительно,экваториальнаяориентацияОН-группыспособствуетобразованию достаточно прочной Н-связи с карбонилом при С-14,вследствие чего гидроксильный протон теряет свою подвижность.Рисунок 18.
1Н ЯМР спектры: А) неперекристаллизованный горминон спримесью следов таксохинона; В) горминон (III); С) таксохинон (V).52Рисунок 19. H,H COSYспектр таксохинона.Ройлеанон и 6,7-дегидроройлеанон имеют практически одинаковоехроматографическое поведение и элюируются с колонки в смеси. В спектре1Н ЯМР 6,7-дегидрорйлеанон дает характеристические дублеты дублетов при6,46 и 6,81 м.д., по которым идентифицируется в смеси с ройлеаноном(Рисунок 20).Рисунок 20.1Н ЯМР спектр ройлеанона (CD3OD, 200 МГц, О-ТМС).*-примесь 6,7-дегидроройлеанона.53О выделении из корней шалфея лекарственного 7-оксоройлеанона донастоящего времени не сообщалось.
Впервые это вещество выделено излистьев абиссинских видов Plectranthus немецкими авторами в 1975 г. [80] ив последующий период информация о выделении 7-оксоройлеанона издругих растительных объектов отсутствовала. Авторы работы [80] полагают,что факт редкого выделения 7-оксоройлеанона из растений объясняетсявысокой окислительной способностью этого вещества.Помимо идентификации всех выделенных нами 6 ройлеанонов переднами стояла задача подтвердить их нативный характер. Особенно этоактуально для минорных компонентов.
Так, хотя авторы работы [124] исходяиз трудности дегидратации таксохинона и горминона даже в жесткихусловиях (п-толуолсульфокислота в кипящем ксилоле) и трудностиокисления ОН при С-7 в тех же соединениях считают, что выделяемые израстений 6,7-дегидроройлеанон и 7-оксоройлеанон не являются артефактами.Нативность двух последний веществ все же необходимо подтвердить. Длярешения этой задачи был использован метод ВЭЖХ.Все выделенные и очищенные перекристаллизацией ройлеаноныохарактеризованы методом ВЭЖХ.
В условиях эксперимента (Глава II) времяудерживания ройлеанона 56.796 мин. (I), горминона 43.956 мин.(III),таксохинона 45.943 мин.(V), ацетата горминона 48.176 мин.(II), 7оскоройлеанона 40.694 мин.(IV), 6,7-дегидроройлеанона 54.987 мин.(VI).Возможны незначительные колебания времени удерживания в разныхэкспериментах. Так для горминона в трех повторностях время удерживаниясоставило 43.956, 43.767 и 44.061 мин. Все указанные пики присутствовалинаВЭЖХ-хроматограммеспиртовогоэкстрактакорнейшалфеялекарственного, что показывает нативный характер выделенных соединений(Рисунок 21).54Рисунок 21.
ВЭЖХ-хроматограмма спиртового экстракта корней шалфея(неочищ.), вкол 2 мкл: I – ройлеанон 56.693 мин, II – ацетат горминона 48.007мин, III – горминон 43.927 мин, IV – 7-оксоройлеанон40.470 мин, V –таксохинон 45.811 мин, VI – 6,7-дегидроройлеанон 55.067 мин.Пиксвременемудерживания44.635мин.принадлежитпаразамещенному фенолу, который не входит в состав антимикробногопрепарата. Он отделяется при очистке ройлеанонов в липидной фракции.Выделенныенамииндивидуальныеройлеаноныбылитакжеохарактеризованы по их антимикробной активности. Это дало возможностьсопоставить их значимость для субстанции антимикробного действия, атакже отметить определенную связь между строением молекулы иантимикробной активностью.Таблица 5Значения антимикробной активности в отношении Staphylococcus aureusдля исследуемых веществВеществоАктивность, мкг/млРойлеанон62,5Горминон15,6Таксохинон15,6 (частично 7,8)7-ацетоксигорминон62,57-оксоройлеанон31,26,7-дегидроройлеанон100055Как видно из приведенных данных (Таблица 5), наибольшаяантимикробная активность в отношении золотистого стафилококка (15,6мкг/мл) наблюдается у соединений со свободной гидроксильной группой приС-7 (горминон, таксохинон).
Несколько ниже, но высокая при наличии у С-7оксогруппы (31,2 мкг/мл). При отсутствии в этом положении кислороднойфункции(ройлеанон)илиацилированиигидроксигруппы(7-ацетоксиройлеанон) активность еще более низкая (62,5 мкг/мл). Придегидратациииобразованиидвойнойсвязи(6,7-дегидроройлеанон)активность резко падает (1000 мгк/мл). ВЭЖХ-хроматограмма показывает,что 6,7-дегидроройлеанон содержится в спиртовом экстракте корней шалфеялекарственного в значительно меньших количествах даже по сравнению сминорным компонентом ройлеаноном. Таким образом, наиболее активным иследовательно, наиболее предпочтительным в составе антимикробногопрепарата компонентом является горминон, как основной из двухстереоизомеров в растительном сырье.3.1.5.
Масс-спектрометрическое изучение ройлеаноновДля подтверждения структуры выделенных соединений наряду свышеописаннымиметодами1НЯМРспектроскопии,определениемтемпературы плавления и непосредственного сравнения с аутентичнымиобразцамиметодомТСХиВЭЖХ,мыиспользовалимасс-спектрометрический метод, где применяется не метод электронного удара, аэлектронный спрей, обуславливающий более мягкую ионизацию [52,76]. Всоответствии с формулой соединений в масс-спектрах присутствуют пикипротонированных молекулярных ионов (Таблица 5).
Фрагментация такженаходится в соответствии со структурной формулой вещества. При этом вотличие от фрагментации под действием электронного удара в данном случаевыявляются определенные общие закономерности распада ройлеанонов. Такна первом этапе распада происходит отрыв воды от протонированной56молекулы ройлеанона. Далее имеет место разрыв связей С1-С10 или С4-С5 споследующим отщеплением соответствующих фрагментов от линейнойцепочки (Таблица 6, Рисунок 22) [2].Рисунок22.Схемараспадамолекулыройлеанонаподдействиемэлектронного спрея.Таблица 6Данные масс-спектров ройлеанонов (электронный спрей)Веществоm/zОтнесение основных пиковРойлеанон317М+ + 1299М+ + 1 – Н2О271(М+ + 1 – Н2О) – (СН2)2257(М+ + 1 – Н2О) – С(СН3)2243(М+ + 1 – Н2О) – CН2-С(СН3)2229(М+ + 1 – Н2О) –(СН2)2-С(СН3)2217(М+ + 1 – Н2О) –(СН2)3-С(СН3)2 +2Н195Отрыв цикла А123 (100%)Разрыв связей С5-С6, С9-С1081цикл А – С(СН3)2m/z123 – m/z436,7-дегидро-315М+ + 1ройлеанон297М+ + 1 – Н2О269(М+ + 1 – Н2О) – (СН2)2259(М+ + 1)– CН2-С(СН3)2255(М+ + 1 – Н2О) – (СН2)3245(М+ + 1) – (СН2)2-С(СН3)257241(М+ + 1 – Н2О) – CН2-С(СН3)2213(М+ + 1 – Н2О) – (CН2)3-С(СН3)27-оксо-331М+ + 1ройлеанон313(М+ + 1) – Н2О289(М+ + 1)– С(СН3)2271(М+ + 1 – Н2О) – С(СН3)2257(М+ + 1 – Н2О) – СН2-С(СН3)2243(М+ + 1 – Н2О) – (СН2)2-С(СН3)2229(М+ + 1 – Н2О) – (СН2)3-С(СН3)2В масс-спектре ройлеанона обращает на себя внимание интенсивныйпик m/z123 (100%).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
