Диссертация (1141374), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Его образование можно объяснить разрывом связей С5С6 (Рисунок 23) и последующим отрывом цикла А (разрыв связей С9-С10).Хотя в последнем случае (связи С9-С10) распад осуществляется не по β-связипо отношению к кратной связи, как это преимущественно имеет место прираспаде непредельных соединений. Возможно, здесь решающую роль играетприоритетность распада с разрывом связей в месте разветвления [2].Рисунок 23. Фрагмент е.Для четкой фиксации пика молекулярного иона, имеющего часто оченьслабую интенсивность, информативна химическая ионизация ионами натрияв электронном спрее. В масс-спектрах горминона, таксохинона и 7ацетоксигорминона наблюдаются пики квазимолекулярных ионов с m/z355,355 и 397 (М+ + 23).
Последние устойчивы вследствие уменьшения энергии58возбуждения, вследствие чего дают пики с очень высокой интенсивностью(Рисунок 24).Рисунок 24. Спектр горминона методом ВЭЖХ-МС (электроспрей).3.2. Пентациклические тритерпеноидыКлекарственномупредставляющемусобойпрепаратурастительногомногокомпонентнуюсмесь,происхождения,предъявляютсятребования по возможности полнее охарактеризовать химическую природувсех компонентов. Основным действующим веществом в разработаннойнами субстанции антимикробного действия Ройлевин является горминон, вкачествеминорныхкомпонентов–7-оскоройлеанон,таксохинониройлеанон.
Содержание горминона в препарате порядка 50%, остальные 50%составляют вещества неройлеаноновой природы.ТехнологияполученияРойлевинавключаетпреобразование7-ацетоксигорминонав более активный горминон в дополнение к нативному59горминону под действием щелочи с последующим подкислением. При этом всостав препарата переходят вещества кислого характера неройлеаноновойприроды. Последние, согласно результатам проведенных нами исследований,представляют собой пентациклические тритерпеноиды.3.2.1. Выделение тритерпеноидов методом колоночной хроматографииСпиртовой экстракт измельченных корней шалфея лекарственноготрехлетнеговозраста,собранныхврайонестаницыВасюринскаяКраснодарского края, полученный трехкратной экстракцией сырья 1:5 96 оэтанолом,упаренныйдо5-6%исходногообъема,разбавлялидистиллированной водой 1:2, полностью отгоняли спирт, разбавлялидополнительно водой (60-70% кубового остатка) и дважды экстрагировалихлороформом.
Соотношение объемов органической и водной фаз ~1:4.Хлороформный экстракт обрабатывали 1% водным раствором гидроксиданатрия 1:3 два раза и 1:5 два раза. Щелочные извлечения подкисляли 5%соляной кислотой, осадок промывали до нейтральной реакции и высушивалипри60оС.содержаниемПолученныйсуммыуказаннымройлеаноновспособом45,6%вобразецРойлевинаколичестве170смгхроматографировали на колонке с силикагелем 40/100µ (15,0 г, h=10,5 см,d=1,5 см), предварительно смешав его с 0,75 г того же силикагеля.Элюирование проводили петролейным эфиром (1 фр.) и смесью петролейныйэфир-хлороформ 3:1 (2 фр.), 1:1 (3-5 фр.), 1:3 (6-17 фр.), хлороформом (18-25фр.), смесью хлороформ-метанол с увеличением градиента последнего от 0,5до 3% (перепад 0,5%, 31-55 фр.). Объем фракций по 10-12 мл.
Из 17-18фракции выделена смесь веществ VII и VIII (2,7 мг). Из 31 фракции (1%-ныйметанол) выделено веществоX (2,5 мг), из 32-33 фракций (1%-ный метанол) –веществоIX (4,5 мг).Вещество XI было выделено из другого опыта. Препарат Ройлевина вколичестве 0,6 г смешали с 3,0 г силикагеля 40/100µ поместили на колонку с60тем же силикагелем (42,0 г, h=15,6 см, d=2,5 см). Элюент – гексан-хлороформс увеличением градиента последнего от 50% до 90% (фракции 1-80, объем45-50 мл) и хлороформ-метанол с увеличением градиента последнего от 0,5%до 3,5% (фракции 81-134, объем 30 мл).
Вещества VII, VIII, X, IX, XI быливыделены из 50-53 (25% хлороформа), 73-83 (100% хлороформ), 87-94 (05,1%метанол), 113-114 (3% метанол) фракций соответственно.Доочистку веществ IX, X, XI проводили рехроматографией на том жесиликагеле, на колонке d=1 см,h=4 см с массой сорбента 3,0-3,3 г (массанеочищенного вещества из фракций 73-83, 87-94, 113-114 порядка 30-40 мг,смешанного с 0,3-0,35 г силикагеля). Элюент хлороформ и хлороформметанол с увеличением градиента метанола от 0,5 до 2%.
Перепад 0,5%.Олеаноловая и урсоловая кислоты из фракций 50-53 не разделялись.3.2.2. Идентификация пентациклических тритерпеноидов.Установление строения нового веществаСмесь веществ VII и VIII на основании данных 1Н ЯМР спектрасостоит из олеаноловой и урсоловой кислот с преобладанием последней.Характеристическими для VII и VIII являются сигналы протона при С-18: дляолеаноловой кислоты дублет дублетов 2,85 м.д. (β-амириновый цикл), дляурсоловой – дублет 2,2 м.д. (производные α-амирина) (Рисунок 25) [55].Кроме того, присутствие в смеси урсоловой кислоты подтверждаетсяналичием двух дублетов 0,85 и 0,94 м.д.
в области сигналов метильныхгрупп.Сигналы олефинового протона и Н-3 для обеих кислот совпадают: 5,25и 3,25 м.д. соответственно. Также полностью совпадают зоны адсорбции VIIи VIII на ТСХ, так что различить их можно только с помощью 1Н ЯМРспектроскопии, как описано выше.61Рисунок 25. 1Н ЯМР спектры: А) олеаноловой кислоты (CDCl3); В) урсоловойкислоты (CDCl3-CD3OD); С) смеси олеаноловой и урсоловой кислот (CDCl3,О-ТМС, 200 МГц).Принадлежность соединений IХ и Х к пентациклическим тритерпенамследует из данных их масс-спектров. В спектре IХ присутствуют пики m/z488 (М+), 472 (10,1%), 470 (3,9%), 442 (7,2%), 426 (4,6%), 368 (8,9%), 316(35,6%), 285 (19,1%), 271 (33,1%), 264 (15,3%), 248 (100%), 223 (26,4%), 219(34,9%), 203 (65,3%), 187 (34,3%).
Пики m/z 264, 248 и 223 связаны с ретро-62диеновым распадом (РДР) молекулы по связям С-9, С-11 и С-8, С-14 цикла Спри наличии Δ12 [5,6,66]. Массовое число пика 264 (циклы D,E)свидетельствует о присутствии в этой частимолекулы трех атомовкислорода, а m/z 223 (циклы А,В) указывает на наличие в этом фрагментемолекулы двух кислородных функций. Одна из кислородных функций (D,E)– карбоксильная группа, по биогенетическим соображениям расположенапри С-17. Ее наличие обусловливает в масс-спектре пики m/z 442 (М-НСОН),m/z 426 (m/z 472-HCOOH, m/z 470-CO2), m/z 219 (m/z 264-COOH), m/z 203(m/z 248-COOH). Положение третьей кислородной функции, ОН-группы, вцикле Е при С-19 однозначно следует из данных 1Н ЯМР спектра.
Сигнал Н18 при 2,5 м.д. представляет собой синглет, что связано с наличием двухзаместителей при С-19 (СН3- и ОН- группы). Из этих же данных дляструктуры IХ осуществляется выбор между производными олеанана и урсанав пользу последнего.
Сигнал метильной группы при С-20 (0,94 м.д., J=6,5 Гц)в виде дублета также согласуется с этим выводом.Две гидроксильные группынаходятся в цикле А, что следует из данных масс-спектра. Разрыв связей С-9,С-10 и С-5, С-6 и отщепление цикла А с m/z 156 дает пики m/z 332 (M + C9H16O2) и 316 (m/z 472-C9H16O2).
Одна ОН-группа находится при С-3.Вицинальное расположение к ОН-группе при С-3 второй ОН-группы следуетиз наличия кросс-пика 3,92 м.д./3,30 м.д. в спектре COSY между сигналамиН-2иН-3.Вопросовзаимномпространственномрасположениигидроксильных групп в молекуле Х решали путем сопоставления слитературнымирасположениюданными[81,90,116,117].функциональныхгруппвРассмотренномускелетеурсанавышеотвечаютэускафиковая (2α,3α) и торментоловая (2α,3β) кислоты. Параметры сигналаметильных групп и Н-2, и Н-3 в 1Н ЯМР спектрах позволяют сделать выбор впользу конкретного стереоизомера: вещество IХ отвечает структуреэускафиковой кислоты С30Н48О5 (Таблица 7).63Таблица 7Химические сдвиги (м.д.) и мультиплетность сигналов дляэускафиковой, торментоловой кислот и вещества XIПоложение Торментоловаяпротонов2Эускафиковая кислотакислота [116,117]3,64[117](ддд); 3,9310,0Гц;11,0Гц; 11,3Гц;3,0Гц3,1Гц32,92 (д)3,33 (д)231,02 (с)0,99 (с)Вещество XI[81](ддд);3,93 (ддд); 12,0Гц;3,5Гц; -3,0 Гц; 2,8Гц3,32 (д)3,29 (д)1,00 (с)0,87 (с)240,81 (с)0,87 (с)0,87 (с)0,99 (с)250,96 (с)0,99 (с)1,00 (с)260,80 (с)0,80 (с)0,82 (с)0,80 (с)271,30 (с)1,35 (с)1,33 (с)1,35 (с)291,20 (с)1,19 (с)1,20 (с)1,20 (с)301,01 (д)0,93 (д)0,92 (д)0,93 (д)Вещество Х так же, как и IХ, по данным 1Н ЯМР и масс-спектровпринадлежиткпентациклическимтритерпенамурсановоготипа.Действительно, масс-спектр Х содержит те же основные пики, что и вспектре вещества IХ: М+ 472 (1,6%), m/z 316 (M+ - С9Н16О2), m/z 248 (D,E),m/z 223 (A,B) – РДР, m/z 203 (m/z 248 -СООН).
Отсутствие пика m/z 264 всочетании с сигналом Н-18 в виде дублета в 1Н ЯМР спектре (2,2 м.д.) и егосмещение в сильное поле по сравнению с 1Н ЯМР спектром IХ (2,52 м.д.)указывает на отсутствие ОН- группы при С-19. Пик m/z 223 в масс спектре Хи сигналы протонов в 1Н ЯМР спектре 3,93 м.д., ддд, J1=12 Гц, J2=J3=2,85 Гц(Н-2)и 3,31 м.д., д, частично перекрывающийся с сигналом растворителя (Н-643) подтверждают наличие ОН-групп при С-2 и С-3. Таким образом Хявляется19-дезоксиэускафиковой кислотой С30Н48О4.Рисунок26.СтруктурныеформулыIX-эускафиковойиX-19-дезоксиэускафиковой кислот.Характер фрагментации молекул эускафиковой кислоты (IX) поддействием электронного удара представлен на Схеме 1.Схема 1.
Распад эускафиковой кислоты под действием электронного удара.65Аналогичнопротекаетифрагментация19-дезоксиэускафиковойкислоты.Принадлежность вещества ХI к пентациклическим тритерпенамследует из данных масс-спектра. В масс-спектре наблюдаются следующиехарактеристические пики: m/z 486, m/z 442, m/z 248 (100%), m/z 223, m/z 219,m/z 203. Характер ретродиенового распада свидетельствует о наличиидвойной связи ∆12[66]. Пик m/z 248 характерен для иона, включающегоциклы D.E, карбоксильную группу, отщепление которой дает пик m/z 203.Пик m/z 248 образуется не из молекулярного иона, а после отщепления изпоследнего двух ОН-групп.
Наличие в масс-спектре пика иона m/z 223,включающего циклы А и В, свидетельствует о расположении двухкислородных функций в этом фрагменте. Слабоинтенсивный пик m/z 486обусловлен ионом, образующимся в результате потери молекулярным иономН2О. Наличие пиков m/z 442 и m/z 219 связано с конкурирующим распадомиона m/z 486 (m/z 486 – CO2) и последующим ретродиеновым распадом собразованием ионов m/z 219 (циклы D, E) и 223 (циклы А,В). Дальнейшаяинформация о структуре вещества ХI следует из данных 1Н ЯМР спектра.Принадлежность вещества ХI к производным β-амирина следует изпараметров сигнала Н-18: дублет дублетов 2,84 м.д., J1=13,6 Гц, J2=4,5 Гц,что свидетельствует об отсутствии заместителя при С-19 и присоединенииобеих СН3-групп к С-20.